s*******r
发帖数: 769 | 1 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
N端block了，没法测序；
没有抗体，没法western；
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
愿闻高见。 |
v**********m
发帖数: 5516 | 2 不是高手的答案。
1，质谱,各种功能实验。
2，功能实验。
3，功能实验。
4，去http://www.abrf.org/index.cfm/dm.details?DMID=235&AvgMass=all&Margin=0，查各种可能到修饰。
5，Mw, 用去糖基化酶处理，看前后分子量对比。
6， 优化溶液条件，如改变离子强度，pH, detergents 等，如果还是沉淀，那就浓度
搞低点。
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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m**z
发帖数: 787 | 3 1. in-gel tryptic digestion followed by MS or MS-MS
2. ESI-MS or functional assay
3. CD denaturation
4. cys oxidation and others? not quite sure, guess depends on the mass
difference
5. not sure... MS-MS?
6. increase salt, change buffer condition, lower temperature, add a ligand
to stabilize, etc.
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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s******y
发帖数: 28562 | 4 有几个地方补充一下
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
把符合尺寸的带切下来，送去做质谱
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
一大堆经典方法。自己去查
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
表达后修饰可以直接用质谱来测。只要你告诉对方你有这个需要，他们就会
给你做
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
质谱是最直接的方法。
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
严格控制条件，一定要加够DTT. 然后把透析的烧杯密封起来
透析完之后，用高速离心把沉淀成分去掉 |
s********n
发帖数: 2939 | 5 一些补充：
native protein or recombinant protein? 功能当然是首选；但如果有tag（如His
tag）就用其抗体检测，没有就当我没说。
首先还是功能检测，在不同温度下incubate不同时间然后测功能；DSC是测Tm的gold
standard
也可以用gel staining
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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s*******r
发帖数: 769 | 6 Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
you still are not sure about the identity of the protein.
for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
welcome more discussion.
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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m**z
发帖数: 787 | 7 for 2: if the MW is not enough for you, you can do MS-MS to essentially "
sequence" the protein, although you can't expect 100% coverage. This is true
for 1 too. MS-MS is just another way to do peptide sequencing.
【在 s*******r 的大作中提到】
: Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
: for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
: for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
: for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
: you still are not sure about the identity of the protein.
: for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
: deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
: for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
: welcome more discussion.
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a***a
发帖数: 40617 | 8 考试就自己做，这里不是做作业版
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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a********k
发帖数: 2273 | 9 赞犀利
【在 a***a 的大作中提到】
: 考试就自己做，这里不是做作业版
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v**********m
发帖数: 5516 | 10 haha
【在 a********k 的大作中提到】
: 赞犀利
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s*******r
发帖数: 769 | 11 这就没劲了，兄弟。讨论总有益处，特别是自己不熟的东西。
俺是千老，考试是N年前的事了。你还挺敏感，别说。hh
【在 a***a 的大作中提到】
: 考试就自己做，这里不是做作业版
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a***a
发帖数: 40617 | 12 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了
【在 s*******r 的大作中提到】
: 这就没劲了，兄弟。讨论总有益处，特别是自己不熟的东西。
: 俺是千老，考试是N年前的事了。你还挺敏感，别说。hh
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w******e
发帖数: 1187 | 13 术业有专攻嘛
【在 a***a 的大作中提到】
: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了
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k******n
发帖数: 133 | 14 For 5, you can use ConA blot, which is easy and straight foward.
Deglycosylation following by SDS_PAGE is good enough to identify Asn-
glycosylation.
You can safely go to MS once the above two is confirmed.
【在 s*******r 的大作中提到】
: Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
: for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
: for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
: for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
: you still are not sure about the identity of the protein.
: for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
: deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
: for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
: welcome more discussion.
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a***a
发帖数: 40617 | 15 是分子生物学，细胞生物学的phd，这种题目连qual都不会出
【在 w******e 的大作中提到】
: 术业有专攻嘛
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s*******r
发帖数: 769 | 16 看样子你水平很高啊
说说你的标准答案 -- 其实真的不容易。泛泛地讲，大家都可以说一堆，具体到一个
问题，就很复杂。
【在 a***a 的大作中提到】
: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了
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a***a
发帖数: 40617 | 17 水平很一般，也就是从ecoli里表达纯化过600kd的complex而已
【在 s*******r 的大作中提到】
: 看样子你水平很高啊
: 说说你的标准答案 -- 其实真的不容易。泛泛地讲，大家都可以说一堆，具体到一个
: 问题，就很复杂。
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n******t
发帖数: 1281 | 18 犀利不是吹的。 呵呵
【在 a***a 的大作中提到】
: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了
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f*********e
发帖数: 1144 | 19 for #4: Variable Modification: met oxidation
Static Modificaiton: cys carboxy-amido-methylation if IAA is used
Other modification should be specified only when the corresponding
enrichment is performed, otherwise many false postive
identifications
will be introduced
【在 m**z 的大作中提到】
: 1. in-gel tryptic digestion followed by MS or MS-MS
: 2. ESI-MS or functional assay
: 3. CD denaturation
: 4. cys oxidation and others? not quite sure, guess depends on the mass
: difference
: 5. not sure... MS-MS?
: 6. increase salt, change buffer condition, lower temperature, add a ligand
: to stabilize, etc.
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U*****t
发帖数: 19 | 20 参考了楼上的答案后给出我回答
酶切+质谱，质谱-质谱应该能确证该蛋白是否存在目标蛋白的片段。
首选 Western Blot；
辅助证明 酶切，看是否产生目标蛋白酶切的片段。
蛋白与它的目标蛋白反应--------- 如用 SPR， Fotebio 等不需纯化好的蛋白
CD， DSC, temperature-dependent fluorescence (有不同称呼 如 Tdf 或
thermFluor）
N-端 去 Met；磷酸化，。。。
质谱-质谱可以 mapping 哪儿进行了修饰
SDS-PAGE 后 Glyco-staining
solubility screening 获得好的溶解条件。一个一个条件地试是比较傻的。
【在 s*******r 的大作中提到】
: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。
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s*******r
发帖数: 769 | 21 不错。谢谢
【在 U*****t 的大作中提到】
: 参考了楼上的答案后给出我回答
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: 酶切+质谱，质谱-质谱应该能确证该蛋白是否存在目标蛋白的片段。
: 首选 Western Blot；
: 辅助证明 酶切，看是否产生目标蛋白酶切的片段。
: 蛋白与它的目标蛋白反应--------- 如用 SPR， Fotebio 等不需纯化好的蛋白
: CD， DSC, temperature-dependent fluorescence (有不同称呼 如 Tdf 或
: thermFluor）
: N-端 去 Met；磷酸化，。。。
: 质谱-质谱可以 mapping 哪儿进行了修饰
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