M*****n
发帖数: 16729 | |
p******x
发帖数: 1264 | |
M*****n
发帖数: 16729 | 3 不是
转基因
【在 p******x 的大作中提到】
: 干吗的,作knock in?
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o********r
发帖数: 775 | 4 Good luck，十多年前一个17-18Kb的plasmid就搞掉我半条命 |
p******x
发帖数: 1264 | 5 我还没达到标准，只整过20k左右的单酶切连接。
反正质粒一长，啥star acivity, 转化效率低下的问题都出来了。我觉得最重要的是纯
化要到位，浓度有保证。转化的菌也有关系，热恢复一定要做的。 |
i*****g
发帖数: 11893 | |
M*****n
发帖数: 16729 | 7 俺也是要做单酶切
25kb+3kb
老天保佑。
几年前作过11KB的搞了一个月。
【在 p******x 的大作中提到】
: 我还没达到标准，只整过20k左右的单酶切连接。
: 反正质粒一长，啥star acivity, 转化效率低下的问题都出来了。我觉得最重要的是纯
: 化要到位，浓度有保证。转化的菌也有关系，热恢复一定要做的。
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p******x
发帖数: 1264 | 8
什么样的菌种对15k以上的转化比较好？据我所知dh5 alpha好像不怎么样。但是也能做
出来。
【在 i*****g 的大作中提到】
: 没有这个经验，要点： 菌株，摇慢点，低温
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M*****n
发帖数: 16729 | 9 invitrogen 最高的效率是电转的DH10B
俺专门买了Bio-rad的电转仪，6000多块，就是为了做这个超大质粒。
【在 p******x 的大作中提到】
:
: 什么样的菌种对15k以上的转化比较好？据我所知dh5 alpha好像不怎么样。但是也能做
: 出来。
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p******x
发帖数: 1264 | 10
你们实验室试验体系控制得怎么样？碰上某些technician，嘿嘿，板子都要自己做。
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺也是要做单酶切
: 25kb+3kb
: 老天保佑。
: 几年前作过11KB的搞了一个月。
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M*****n
发帖数: 16729 | 11 我们都是自己弄的
我们这儿的technician都有自己的project.
【在 p******x 的大作中提到】
:
: 你们实验室试验体系控制得怎么样？碰上某些technician，嘿嘿，板子都要自己做。
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p******x
发帖数: 1264 | 12 那我感觉还好阿，每一步把好关没准2星期就出来了。没star activity的话会省很多心
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r****o
发帖数: 105 | 13
质粒到了20kb以上就变得不太稳定，尤其是有重复的序列（比如LoxP),有可能会丢
片断，要特别小心。
【在 M*****n 的大作中提到】
: 有做过25-30Kb的质粒的吗？
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