m********r
发帖数: 124 | 1 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
了始终没解决，特上来求救：
是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
不干净。过个Gel filtration 也分不开。
这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
在黏菌的基因组中，它是跟另一个蛋白在一块的，我可以尝试共表达他们两个，但问题
是，我们的目的是验证这两个蛋白的相互作用，如果这样，我得到了稳定的蛋白
complex，再怎么分开他们呢？
确实很头大，眼看着这个蛋白拿不到，（另一个蛋白早就拿到了，HSQC也有了）想做的
蛋白相互作用没法进行下去，望板上牛人指点迷津。 |
A****w
发帖数: 244 | 2 跑个胶，拿出杂质蛋白，做个trypsin digested MALDI看看杂质是什么。
50%的soluble是不是分离的蛋白可能是聚集体？试试低温表达。
有loop不稳定结构，加arg+glu到buffer里，是不是可以增加蛋白的溶解特性。
暂时就想到这些。 |
m********r
发帖数: 124 | 3 1.老板也说了，但是暗示对现有project意义不大，因为我们就需要的大量的蛋白做个
相互作用的HSQC，所以暂时不主张做
2,我已经18度了，不能再低了吧
3.这个我倒听说过，防止蛋白聚集沉淀吧，可以在Ni柱的buffer里加码？ |
C*******e
发帖数: 4348 | 4 你把这个蛋白跟另外一个共表达，一个有tag，一个没有
如果出来complex，（native gel, SEC），不是也是一个他们相互作用的证据么？
另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少？
还有如果实在不行，可以denature条件下纯化这个蛋白
13 kDa这么小，重折叠不是什么大问题
另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多，不如试试你的GST-tag的那个
虽然一开始表达的少
但大不了多摇点菌
GST应该可以帮助稳定这个蛋白
前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
纯化好了蛋白再把GST切掉（我假设你的fusion protein是有特异性蛋白水解酶酶切位
点给你切GST的） |
m**z
发帖数: 787 | 5 50% 可溶，如果表达良好的话还是可以接受的。
杂蛋白，到底是impurity还是degrading product? gel-filtration分不开，能不能试
试ion exchange column,比如monoQ.用的什么蛋白酶抑制剂？PMSF? 试试看sigma的
inhibitor cocktail?
最后拿到的蛋白纯度大概有多少？如果有80%的话，也许做binding也可以了。mass
spec可以确定那些是不是降解产物。如果是的话，还可以告诉你是在哪里降解的。也许
可以通过mutate那个residue来达到减少降解的目的
【在 m********r 的大作中提到】
: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
|
k****u
发帖数: 3454 | 6 Reverse phase LC是个好东西。。。
可以RPLC分离的。。。
【在 m********r 的大作中提到】
: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
|
m**z
发帖数: 787 | 7 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已，一般不会去这么干吧
【在 k****u 的大作中提到】
: Reverse phase LC是个好东西。。。
: 可以RPLC分离的。。。
|
m********r
发帖数: 124 | 8 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
mutant;
2.buffer里面是250mM,应该不低吧
3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
的了？
4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你把这个蛋白跟另外一个共表达，一个有tag，一个没有
: 如果出来complex，（native gel, SEC），不是也是一个他们相互作用的证据么？
: 另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少？
: 还有如果实在不行，可以denature条件下纯化这个蛋白
: 13 kDa这么小，重折叠不是什么大问题
: 另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多，不如试试你的GST-tag的那个
: 虽然一开始表达的少
: 但大不了多摇点菌
: GST应该可以帮助稳定这个蛋白
: 前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
|
s*******e
发帖数: 1010 | 9 try on-gel cleavage instead of eluting with imidazole |
m**z
发帖数: 787 | 10 1. 如果另一个蛋白你有很多的话，不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
些是杂蛋白，不应该影响你的HSQC吧？（assuming the other protein is N15-
labeled)
【在 m********r 的大作中提到】
: 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
: mutant;
: 2.buffer里面是250mM,应该不低吧
: 3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
: 的了？
: 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
|
|
|
k****u
发帖数: 3454 | 11 用salt和water，不要用organic solvent，可以minimize denaturation
当然，我没干过，只是纸上谈兵-_-
【在 m**z 的大作中提到】
: 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已，一般不会去这么干吧
|
C*******e
发帖数: 4348 | 12 "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
——250 mM还好啦
试试看500 mM
给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
一个选择
【在 m********r 的大作中提到】
: 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
: mutant;
: 2.buffer里面是250mM,应该不低吧
: 3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
: 的了？
: 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
|
s********n
发帖数: 2939 | 13 建议试试用Cobalt的柱子代替Ni的柱子，我的蛋白用Cobalt的柱子一步就>90%，很顺利
做出结晶。 |
e****s
发帖数: 1125 | 14 为什么不在Nickle以后试一下离子交换柱子或者疏水柱子？
【在 m********r 的大作中提到】
: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
|
m********r
发帖数: 124 | 15 Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了，250或者 500的盐都是，我都不好意思上我的胶图
了，我的融合蛋白量（25KD）在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白，但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子，主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的；
GST 我有另一个麻烦，就是free GST很多，摇再多的菌，也有一半以上的GST 结合到
beads上，fusion protein相对结合的少啊，这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换，我还没试。但我想尝试上来就用它，而不是Ni之后。我们没有mono的
，都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊，我在国内的时候
试过，不是很好用。
【在 C*******e 的大作中提到】
: "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
: ——250 mM还好啦
: 试试看500 mM
: 给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
: 另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
: 我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
: refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
: 一个选择
|
m********r
发帖数: 124 | 16 你指的是我label另一个蛋白，用这个不纯的蛋白做titration吧，还是反过来label？
我前者已经做了，但是要想完成titration，需要量很大啊（10：1 molar equivalent
）差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱，又得不
到纯蛋白了
【在 m**z 的大作中提到】
: 1. 如果另一个蛋白你有很多的话，不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
: 些是杂蛋白，不应该影响你的HSQC吧？（assuming the other protein is N15-
: labeled)
|
m**z
发帖数: 787 | 17 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话，HSQC 100uM 甚至更
低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢？
GSTtag如果work的话，多纯化几批能不能work呢？
前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白，你的蛋白多大呀？这两个蛋白的分子量加起来和你
的蛋白比怎么样？
equivalent
【在 m********r 的大作中提到】
: 你指的是我label另一个蛋白，用这个不纯的蛋白做titration吧，还是反过来label？
: 我前者已经做了，但是要想完成titration，需要量很大啊（10：1 molar equivalent
: ）差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱，又得不
: 到纯蛋白了
|
m********r
发帖数: 124 | 18 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
不知道谁的对；
我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
蛋白的N端，有可能吗？
【在 m**z 的大作中提到】
: 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话，HSQC 100uM 甚至更
: 低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢？
: GSTtag如果work的话，多纯化几批能不能work呢？
: 前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白，你的蛋白多大呀？这两个蛋白的分子量加起来和你
: 的蛋白比怎么样？
:
: equivalent
|
C*******e
发帖数: 4348 | 19 如果你担心fusion protein从中间断了，elution里才会有两条蛋白带
那就做个his-tag的WB好了
两个都有his-tag就证明你的担心是对的
【在 m********r 的大作中提到】
: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？
|
m**z
发帖数: 787 | 20 要做assignment就没折了。。。
挺有可能从中间断了。。。in-gel tryptic digestion followed by MS-MS 可以确定
的告诉你，不过我也不知道这个信息对你有多大用处。。。我之前说聊唯一好处是你可
以make mutation,把那个residue换掉。反正挺折腾得。。。
【在 m********r 的大作中提到】
: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？
|
|
|
s********s
发帖数: 67 | 21 13KD的蛋白加上这么大的一个tag可能会影响相互作用。
【在 m********r 的大作中提到】
: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？
|
i*****g
发帖数: 11893 | 22 唉， 年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答 |
C*******e
发帖数: 4348 | 23 您这不是码了字了么～～
年纪大了，经验多了，更要提携新人啊～
【在 i*****g 的大作中提到】
: 唉， 年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答
|
m********r
发帖数: 124 | 24 对啊，希望您不吝指教啊
【在 i*****g 的大作中提到】
: 唉， 年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答
|
z******g
发帖数: 5 | 25
1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情，从你的电泳图来看，那已经很纯了。下次
优化一下
ni column的过程，再过个Q、S，gel filtration之类的，那点杂带早就不见了。而且
你做NMR，
又不用结晶，也用不着那么纯。
2.做complex的都愁着蛋白不结合，没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢，提
高NaCl浓
度，离子交换什么的都可以试试
【在 m********r 的大作中提到】
: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
|
m********r
发帖数: 124 | 26 第二点我老板倒也说过，提高盐浓度；
第一点你说的基本也对，不过，那不是我的胶图啊，我要是那纯化效果，就不来费这个
事儿了，
【在 z******g 的大作中提到】
:
: 1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情，从你的电泳图来看，那已经很纯了。下次
: 优化一下
: ni column的过程，再过个Q、S，gel filtration之类的，那点杂带早就不见了。而且
: 你做NMR，
: 又不用结晶，也用不着那么纯。
: 2.做complex的都愁着蛋白不结合，没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢，提
: 高NaCl浓
: 度，离子交换什么的都可以试试
|
