m********r 发帖数: 124 | 1 版上牛人多,上次的菌落PCR感谢各位已经解决,现在有个新蛋白纯化的问题,快半年
了始终没解决,特上来求救:
是一个粘菌中的小蛋白13KD左右,遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题,
在100%的buffer B (300mM咪唑)下来,总是还有很多别的杂蛋白,这些杂蛋白似乎洗
不干净。过个Gel filtration 也分不开。
这个蛋白确实知道的很少,BLAST就出来10个左右,第三个e-value已经是1.5了。我怀
疑是降解得问题,因为去预测结构的时候,只有后面的70个氨基酸给了预测的结果,前
面都没结果,而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
是我加了蛋白酶抑制剂,没啥作用。
在黏菌的基因组中,它是跟另一个蛋白在一块的,我可以尝试共表达他们两个,但问题
是,我们的目的是验证这两个蛋白的相互作用,如果这样,我得到了稳定的蛋白
complex,再怎么分开他们呢?
确实很头大,眼看着这个蛋白拿不到,(另一个蛋白早就拿到了,HSQC也有了)想做的
蛋白相互作用没法进行下去,望板上牛人指点迷津。 |
A****w 发帖数: 244 | 2 跑个胶,拿出杂质蛋白,做个trypsin digested MALDI看看杂质是什么。
50%的soluble是不是分离的蛋白可能是聚集体?试试低温表达。
有loop不稳定结构,加arg+glu到buffer里,是不是可以增加蛋白的溶解特性。
暂时就想到这些。 |
m********r 发帖数: 124 | 3 1.老板也说了,但是暗示对现有project意义不大,因为我们就需要的大量的蛋白做个
相互作用的HSQC,所以暂时不主张做
2,我已经18度了,不能再低了吧
3.这个我倒听说过,防止蛋白聚集沉淀吧,可以在Ni柱的buffer里加码? |
C*******e 发帖数: 4348 | 4 你把这个蛋白跟另外一个共表达,一个有tag,一个没有
如果出来complex,(native gel, SEC),不是也是一个他们相互作用的证据么?
另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少?
还有如果实在不行,可以denature条件下纯化这个蛋白
13 kDa这么小,重折叠不是什么大问题
另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多,不如试试你的GST-tag的那个
虽然一开始表达的少
但大不了多摇点菌
GST应该可以帮助稳定这个蛋白
前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
纯化好了蛋白再把GST切掉(我假设你的fusion protein是有特异性蛋白水解酶酶切位
点给你切GST的) |
m**z 发帖数: 787 | 5 50% 可溶,如果表达良好的话还是可以接受的。
杂蛋白,到底是impurity还是degrading product? gel-filtration分不开,能不能试
试ion exchange column,比如monoQ.用的什么蛋白酶抑制剂?PMSF? 试试看sigma的
inhibitor cocktail?
最后拿到的蛋白纯度大概有多少?如果有80%的话,也许做binding也可以了。mass
spec可以确定那些是不是降解产物。如果是的话,还可以告诉你是在哪里降解的。也许
可以通过mutate那个residue来达到减少降解的目的
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 版上牛人多,上次的菌落PCR感谢各位已经解决,现在有个新蛋白纯化的问题,快半年 : 了始终没解决,特上来求救: : 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右,遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His- : GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题, : 在100%的buffer B (300mM咪唑)下来,总是还有很多别的杂蛋白,这些杂蛋白似乎洗 : 不干净。过个Gel filtration 也分不开。 : 这个蛋白确实知道的很少,BLAST就出来10个左右,第三个e-value已经是1.5了。我怀 : 疑是降解得问题,因为去预测结构的时候,只有后面的70个氨基酸给了预测的结果,前 : 面都没结果,而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但 : 是我加了蛋白酶抑制剂,没啥作用。
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k****u 发帖数: 3454 | 6 Reverse phase LC是个好东西。。。
可以RPLC分离的。。。
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 版上牛人多,上次的菌落PCR感谢各位已经解决,现在有个新蛋白纯化的问题,快半年 : 了始终没解决,特上来求救: : 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右,遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His- : GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题, : 在100%的buffer B (300mM咪唑)下来,总是还有很多别的杂蛋白,这些杂蛋白似乎洗 : 不干净。过个Gel filtration 也分不开。 : 这个蛋白确实知道的很少,BLAST就出来10个左右,第三个e-value已经是1.5了。我怀 : 疑是降解得问题,因为去预测结构的时候,只有后面的70个氨基酸给了预测的结果,前 : 面都没结果,而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但 : 是我加了蛋白酶抑制剂,没啥作用。
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m**z 发帖数: 787 | 7 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已,一般不会去这么干吧
【在 k****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Reverse phase LC是个好东西。。。 : 可以RPLC分离的。。。
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m********r 发帖数: 124 | 8 1.你说的很对,但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
mutant;
2.buffer里面是250mM,应该不低吧
3.如果本身是个没有高级结构的话,refolding似乎问题也不少吧,怎么知道变回天然
的了?
4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你把这个蛋白跟另外一个共表达,一个有tag,一个没有 : 如果出来complex,(native gel, SEC),不是也是一个他们相互作用的证据么? : 另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少? : 还有如果实在不行,可以denature条件下纯化这个蛋白 : 13 kDa这么小,重折叠不是什么大问题 : 另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多,不如试试你的GST-tag的那个 : 虽然一开始表达的少 : 但大不了多摇点菌 : GST应该可以帮助稳定这个蛋白 : 前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
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s*******e 发帖数: 1010 | 9 try on-gel cleavage instead of eluting with imidazole |
m**z 发帖数: 787 | 10 1. 如果另一个蛋白你有很多的话,不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
些是杂蛋白,不应该影响你的HSQC吧?(assuming the other protein is N15-
labeled)
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1.你说的很对,但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计 : mutant; : 2.buffer里面是250mM,应该不低吧 : 3.如果本身是个没有高级结构的话,refolding似乎问题也不少吧,怎么知道变回天然 : 的了? : 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
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k****u 发帖数: 3454 | 11 用salt和water,不要用organic solvent,可以minimize denaturation
当然,我没干过,只是纸上谈兵-_-
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已,一般不会去这么干吧
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C*******e 发帖数: 4348 | 12 "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
——250 mM还好啦
试试看500 mM
给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
refold能不能回到native?这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
一个选择
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1.你说的很对,但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计 : mutant; : 2.buffer里面是250mM,应该不低吧 : 3.如果本身是个没有高级结构的话,refolding似乎问题也不少吧,怎么知道变回天然 : 的了? : 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。
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s********n 发帖数: 2939 | 13 建议试试用Cobalt的柱子代替Ni的柱子,我的蛋白用Cobalt的柱子一步就>90%,很顺利
做出结晶。 |
e****s 发帖数: 1125 | 14 为什么不在Nickle以后试一下离子交换柱子或者疏水柱子?
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 版上牛人多,上次的菌落PCR感谢各位已经解决,现在有个新蛋白纯化的问题,快半年 : 了始终没解决,特上来求救: : 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右,遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His- : GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题, : 在100%的buffer B (300mM咪唑)下来,总是还有很多别的杂蛋白,这些杂蛋白似乎洗 : 不干净。过个Gel filtration 也分不开。 : 这个蛋白确实知道的很少,BLAST就出来10个左右,第三个e-value已经是1.5了。我怀 : 疑是降解得问题,因为去预测结构的时候,只有后面的70个氨基酸给了预测的结果,前 : 面都没结果,而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但 : 是我加了蛋白酶抑制剂,没啥作用。
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m********r 发帖数: 124 | 15 Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了,250或者 500的盐都是,我都不好意思上我的胶图
了,我的融合蛋白量(25KD)在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白,但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子,主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的;
GST 我有另一个麻烦,就是free GST很多,摇再多的菌,也有一半以上的GST 结合到
beads上,fusion protein相对结合的少啊,这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换,我还没试。但我想尝试上来就用它,而不是Ni之后。我们没有mono的
,都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊,我在国内的时候
试过,不是很好用。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : "2.buffer里面是250mM,应该不低吧" : ——250 mM还好啦 : 试试看500 mM : 给你看个我的某个his蛋白纯化的比较 : 另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小 : 我反而觉得大一点的tag可能更有帮助 : refold能不能回到native?这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后 : 一个选择
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m********r 发帖数: 124 | 16 你指的是我label另一个蛋白,用这个不纯的蛋白做titration吧,还是反过来label?
我前者已经做了,但是要想完成titration,需要量很大啊(10:1 molar equivalent
)差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱,又得不
到纯蛋白了
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1. 如果另一个蛋白你有很多的话,不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那 : 些是杂蛋白,不应该影响你的HSQC吧?(assuming the other protein is N15- : labeled)
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m**z 发帖数: 787 | 17 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话,HSQC 100uM 甚至更
低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢?
GSTtag如果work的话,多纯化几批能不能work呢?
前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白,你的蛋白多大呀?这两个蛋白的分子量加起来和你
的蛋白比怎么样?
equivalent
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你指的是我label另一个蛋白,用这个不纯的蛋白做titration吧,还是反过来label? : 我前者已经做了,但是要想完成titration,需要量很大啊(10:1 molar equivalent : )差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱,又得不 : 到纯蛋白了
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m********r 发帖数: 124 | 18 如果要知道binding site不就得做assignment嘛,现在做不了。因为只有1:1的量。加
上我蛋白后看到了几个新的峰,我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
loop,(峰看不到)但我老板说是titration没做完,所以原来的峰没完全消失,我也
不知道谁的对;
我蛋白13KD,加上tag大约25KD,(N端GB1加上linker,his tag之类的不到10KD)。要
是结合在柱上这么牢,我觉得可能就是从我蛋白中间断了,省下个his tag-GB1加上我
蛋白的N端,有可能吗?
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话,HSQC 100uM 甚至更 : 低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢? : GSTtag如果work的话,多纯化几批能不能work呢? : 前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白,你的蛋白多大呀?这两个蛋白的分子量加起来和你 : 的蛋白比怎么样? : : equivalent
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C*******e 发帖数: 4348 | 19 如果你担心fusion protein从中间断了,elution里才会有两条蛋白带
那就做个his-tag的WB好了
两个都有his-tag就证明你的担心是对的
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果要知道binding site不就得做assignment嘛,现在做不了。因为只有1:1的量。加 : 上我蛋白后看到了几个新的峰,我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右 : loop,(峰看不到)但我老板说是titration没做完,所以原来的峰没完全消失,我也 : 不知道谁的对; : 我蛋白13KD,加上tag大约25KD,(N端GB1加上linker,his tag之类的不到10KD)。要 : 是结合在柱上这么牢,我觉得可能就是从我蛋白中间断了,省下个his tag-GB1加上我 : 蛋白的N端,有可能吗?
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m**z 发帖数: 787 | 20 要做assignment就没折了。。。
挺有可能从中间断了。。。in-gel tryptic digestion followed by MS-MS 可以确定
的告诉你,不过我也不知道这个信息对你有多大用处。。。我之前说聊唯一好处是你可
以make mutation,把那个residue换掉。反正挺折腾得。。。
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果要知道binding site不就得做assignment嘛,现在做不了。因为只有1:1的量。加 : 上我蛋白后看到了几个新的峰,我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右 : loop,(峰看不到)但我老板说是titration没做完,所以原来的峰没完全消失,我也 : 不知道谁的对; : 我蛋白13KD,加上tag大约25KD,(N端GB1加上linker,his tag之类的不到10KD)。要 : 是结合在柱上这么牢,我觉得可能就是从我蛋白中间断了,省下个his tag-GB1加上我 : 蛋白的N端,有可能吗?
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s********s 发帖数: 67 | 21 13KD的蛋白加上这么大的一个tag可能会影响相互作用。
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果要知道binding site不就得做assignment嘛,现在做不了。因为只有1:1的量。加 : 上我蛋白后看到了几个新的峰,我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右 : loop,(峰看不到)但我老板说是titration没做完,所以原来的峰没完全消失,我也 : 不知道谁的对; : 我蛋白13KD,加上tag大约25KD,(N端GB1加上linker,his tag之类的不到10KD)。要 : 是结合在柱上这么牢,我觉得可能就是从我蛋白中间断了,省下个his tag-GB1加上我 : 蛋白的N端,有可能吗?
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i*****g 发帖数: 11893 | 22 唉, 年纪大了。没有耐心了,要是几年前,还有兴致码字回答 |
C*******e 发帖数: 4348 | 23 您这不是码了字了么~~
年纪大了,经验多了,更要提携新人啊~
【在 i*****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 唉, 年纪大了。没有耐心了,要是几年前,还有兴致码字回答
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m********r 发帖数: 124 | 24 对啊,希望您不吝指教啊
【在 i*****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 唉, 年纪大了。没有耐心了,要是几年前,还有兴致码字回答
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z******g 发帖数: 5 | 25
1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情,从你的电泳图来看,那已经很纯了。下次
优化一下
ni column的过程,再过个Q、S,gel filtration之类的,那点杂带早就不见了。而且
你做NMR,
又不用结晶,也用不着那么纯。
2.做complex的都愁着蛋白不结合,没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢,提
高NaCl浓
度,离子交换什么的都可以试试
【在 m********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 版上牛人多,上次的菌落PCR感谢各位已经解决,现在有个新蛋白纯化的问题,快半年 : 了始终没解决,特上来求救: : 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右,遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His- : GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题, : 在100%的buffer B (300mM咪唑)下来,总是还有很多别的杂蛋白,这些杂蛋白似乎洗 : 不干净。过个Gel filtration 也分不开。 : 这个蛋白确实知道的很少,BLAST就出来10个左右,第三个e-value已经是1.5了。我怀 : 疑是降解得问题,因为去预测结构的时候,只有后面的70个氨基酸给了预测的结果,前 : 面都没结果,而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但 : 是我加了蛋白酶抑制剂,没啥作用。
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m********r 发帖数: 124 | 26 第二点我老板倒也说过,提高盐浓度;
第一点你说的基本也对,不过,那不是我的胶图啊,我要是那纯化效果,就不来费这个
事儿了,
【在 z******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情,从你的电泳图来看,那已经很纯了。下次 : 优化一下 : ni column的过程,再过个Q、S,gel filtration之类的,那点杂带早就不见了。而且 : 你做NMR, : 又不用结晶,也用不着那么纯。 : 2.做complex的都愁着蛋白不结合,没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢,提 : 高NaCl浓 : 度,离子交换什么的都可以试试
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