s*******e
发帖数: 17 | 1 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
抗体做western检测药物处理前后
的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
常明显。从分子量判断，这个条带
肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
不到那个70kD分子量位置有蛋白变
化。
我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。 |
d***y
发帖数: 195 | 2 我以前有过类似经验、姑且介绍、
你的判断比较一厢情愿、药物处理后、很难说会发生什么、会有特定现象通过WB显现出
来。
如果你一定认为这是个有意思的现象、值得追究、
不妨、
切条带做MS鉴定、了解到底是什么东西、然后再谈其他、
其次、如果是个有意思的现象、抗体染色可以尝试、但之前可用GFP tag之类的作萤光
live imaging
药物处理前后比较、
古得拉客
【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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s*******e
发帖数: 17 | 3 谢谢回复。
我也知道这个未知蛋白是不是真的有价值现在还很难说。我只是想试一下看看。
你说切条带是指从胶上切还是膜上切？如果是从胶上切的话，染色灵敏度不够看不到条
带。如果是从膜上切的话，我担心一抗，二抗附在条带上,MS很难鉴定。我对MS没有经
验，所以不知道我的担心是不是有道理。谢谢。 |
p****p
发帖数: 3360 | 4 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 有一个可能性是那个蛋白就是你想要的，只不过在处理后会表达出/或者被局部水解出
一个比较小的形式。
你可以试着用不同的protein A的抗体来看看，如果也能检测出那个带，应该就是了
【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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s*******e
发帖数: 17 | 6 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。 |
e****s
发帖数: 1125 | 7 另一个抗体检测不出来也不一定表示就不是那个130kD的降解产物，取决于抗体的识别
位点。
50kD以下有没有明显的条带呢？
【在 s*******e 的大作中提到】
: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。
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s******s
发帖数: 13035 | 8 //nod, 简洁明快, 标准做法.
【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。
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M*****n
发帖数: 16729 | 9 run 2D gel before mass spec
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod, 简洁明快, 标准做法.
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s******s
发帖数: 13035 | 10 个人觉得没啥必要, 都已经affinity purify过一遍了, 2D有点over了.
另外, SDS-PAGE work的蛋白2D不一定work
【在 M*****n 的大作中提到】
: run 2D gel before mass spec
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v***a
发帖数: 1242 | 11 正被mass spec弄得有点晕
看了几篇paper也不太知所云
这个说得真是简洁 令人一目了然
【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。
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l****y
发帖数: 398 | 12 make some informed guesses and screen gfp fusion strain libary
【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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c******y
发帖数: 148 | |
s*******e
发帖数: 17 | 14 呵呵，即使是hsp70也算是新发现，因为以前并没有报道这个药物可以诱导hsp70表达 |
l*********s
发帖数: 5409 | 15 It seems that the x protein is unrelated to A, why don't you do a direct microarray
to study differential expressions than sticking on protein X?
【在 s*******e 的大作中提到】
: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。
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t****p
发帖数: 1504 | 16 一般这种情况不值得深究。一个药物处理之后，显著变化的蛋白和mRNA不计其数，只是
恰巧有一个被你的抗体识别了。
用这个蛋白A的抗体的抗原序列做个搜索，先看看有没有大约70kd的同源蛋白。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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W****7
发帖数: 426 | 17 我认为IP不一定work，WB能识别，很多情况下IP不work。我曾经也想做过类似的东西，
合作人的建议是转膜然后，在膜上染色切带，测序。 |
c******r
发帖数: 3778 | 18 基本就是最好办法了。
除了Coomassie，也可以silver stain，更sensitive一点，也许可以cut得更准些。
但是我看其实这个追究的意义可能真的不大。不过想玩儿，就玩儿玩儿好了。
【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。
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C*4
发帖数: 10 | 19 我以前做过western之后的膜上酶切，再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤，效果
还可以。 |
C*4
发帖数: 10 | 20 这篇文章，也许对你有帮助。
Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
(2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.
【在 C*4 的大作中提到】
: 我以前做过western之后的膜上酶切，再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤，效果
: 还可以。
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b******n
发帖数: 4225 | 21 哈哈，我也有同感，很可能是chaperone
取决于当初抗原怎么制备的
【在 c******y 的大作中提到】
: 打击一下楼主，呵呵，不会是hsp70吧
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h****u
发帖数: 480 | 22
T.A.
protein
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Identification of Direct Protein Targets of Small Molecules
Brett Lomenick, Richard W. Olsen, and Jing Huang
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb100294v?
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【在 C*4 的大作中提到】
: 这篇文章，也许对你有帮助。
: Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
: (2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
: identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.
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