w******e 发帖数: 1187 | 1 请大家帮忙看看附件:6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer,以及
0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein,RNA MW ~30kD,protein MW ~200kD,PI
~5.3。用的是6% PAGE gel,没调pH。
主要有两大问题:1. free RNA band(bottom bands)是smear,而且band intensity
非常
低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
2. 如果只是这一点也就罢了,从RNA-protein complex band应该就能得到kD,可是
0protein
smaple就有两条band,杯具。。。
之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample,也都有两条band,所以
不是某一
个sample screw up;2. 怀疑protein-RNA complex没有入胶,改用4%gel(以前做过
staining,free protein 4% gel之下肯定能入胶),结果和附件基本一样。
上来请教一下:1. 小MW的free RNA的这种band pattern正常吗?能改进吗?2. 有人见
过0
protein sample有"complex band"的情况吗?我还是怀疑protein-RNA complex没入胶
,然后
free RNA somehow也有部分没有入胶,所以superimpose到一起。可是为什么会发生就
没有一点头
绪了。BTW我用同一批sample做过filter binding assay,结果很正常(0protein
background很小,signal随protein conc.而上升直到plateau)。
请牛人指点。多谢! |
a****k 发帖数: 1130 | 2 我觉得,你要是把自己的实验过程稍微详细点的描述一下,或者大家会比较容易提建议
PI
intensity
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请大家帮忙看看附件:6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer,以及 : 0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein,RNA MW ~30kD,protein MW ~200kD,PI : ~5.3。用的是6% PAGE gel,没调pH。 : 主要有两大问题:1. free RNA band(bottom bands)是smear,而且band intensity : 非常 : 低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。 : 2. 如果只是这一点也就罢了,从RNA-protein complex band应该就能得到kD,可是 : 0protein : smaple就有两条band,杯具。。。 : 之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample,也都有两条band,所以
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I*****y 发帖数: 6402 | 3 RNA probe是怎么做的呀?
PI
intensity
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请大家帮忙看看附件:6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer,以及 : 0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein,RNA MW ~30kD,protein MW ~200kD,PI : ~5.3。用的是6% PAGE gel,没调pH。 : 主要有两大问题:1. free RNA band(bottom bands)是smear,而且band intensity : 非常 : 低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。 : 2. 如果只是这一点也就罢了,从RNA-protein complex band应该就能得到kD,可是 : 0protein : smaple就有两条band,杯具。。。 : 之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample,也都有两条band,所以
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w******e 发帖数: 1187 | 4 能不能说说你指哪些过程?incubation吗?gel loading?
我其实不知道有哪些是关键步骤-_-
谢啦!
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得,你要是把自己的实验过程稍微详细点的描述一下,或者大家会比较容易提建议 : : PI : intensity
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w******e 发帖数: 1187 | 5 RNA: in vitro transcription+phenol+Urea PAGE purification+elutrap+
column desalt。
radiolabeling:artarctic phosphatase,heat inactivate。PNK+P32 ATP,
heat inactivate。column purify+desalt
thx!
【在 I*****y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : RNA probe是怎么做的呀? : : PI : intensity
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T**********t 发帖数: 1604 | 6 看起来像是RNA没跑进胶里的缘故,你的sample buffer和running buffer是什么,会不
会RNA的电荷被中和了跑不动啊?30kD用4%的胶应该肯定能跑进去没问题。
而且为什么你的sample不管是upper band还是bottom band,看起来从左到右都有增加
的趋势?我没做过同位素标记的胶,不知道是不是曝光或者聚焦哪里有不对还是怎么回
事。 |
w******e 发帖数: 1187 | 7 sample buffer: PBS+DNA loading buffer; running buffer: TBE.
我平时run cold RNA都是用这个buffer system没出过问题,不过平时用的gel都是
10% premade gel,room temperature,还是有点不太一样。
upper band有增加我觉得是complex增加的缘故(不考虑极高background的话能fit出
Kd-_-),bottom band确实不应该,我也不知为啥。。。
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 看起来像是RNA没跑进胶里的缘故,你的sample buffer和running buffer是什么,会不 : 会RNA的电荷被中和了跑不动啊?30kD用4%的胶应该肯定能跑进去没问题。 : 而且为什么你的sample不管是upper band还是bottom band,看起来从左到右都有增加 : 的趋势?我没做过同位素标记的胶,不知道是不是曝光或者聚焦哪里有不对还是怎么回 : 事。
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T**********t 发帖数: 1604 | 8 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer,用TBE跑不动,我也不知道原
因,但是TBE就是跑不动。
upper band强度增加是应该的,但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加
的RNA量是一样的,所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这
样么?
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : sample buffer: PBS+DNA loading buffer; running buffer: TBE. : 我平时run cold RNA都是用这个buffer system没出过问题,不过平时用的gel都是 : 10% premade gel,room temperature,还是有点不太一样。 : : upper band有增加我觉得是complex增加的缘故(不考虑极高background的话能fit出 : Kd-_-),bottom band确实不应该,我也不知为啥。。。
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a****k 发帖数: 1130 | 9 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧?根据我自己的经验,100nt的RNA再加
上个200kD的蛋白,是很难跑进6%的acrylamide gel的,所以要是我的话一般会选择用
agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强,我怀疑是不是你的
incubation buffer有RNase能degrade你的probe,然后很有可能你的蛋白本身能bind
probe,所以蛋白加多了也就保护了RNA
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能不能说说你指哪些过程?incubation吗?gel loading? : 我其实不知道有哪些是关键步骤-_- : 谢啦!
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w******e 发帖数: 1187 | 10 bottom band不是每次都强,而是比较random-_-我只run了两三块gel,没发现
bottom band有什么规律。。。
这个还真没想到。。。回头试试看。谢啦!
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer,用TBE跑不动,我也不知道原 : 因,但是TBE就是跑不动。 : upper band强度增加是应该的,但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加 : 的RNA量是一样的,所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这 : 样么?
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w******e 发帖数: 1187 | 11
多谢!我最初的想法是我run free protein都能入胶,加上RNA应该更方便,不过也许
未必。用agarose gel能做radio吗?PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里,不用太担心
P32 contaminate gel casette。
我的RNA是2'-F modified,通常没有degradation的问题。
and最后的最后,我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死
用我的system free RNA就不入胶。。。
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧?根据我自己的经验,100nt的RNA再加 : 上个200kD的蛋白,是很难跑进6%的acrylamide gel的,所以要是我的话一般会选择用 : agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强,我怀疑是不是你的 : incubation buffer有RNase能degrade你的probe,然后很有可能你的蛋白本身能bind : probe,所以蛋白加多了也就保护了RNA
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T**********t 发帖数: 1604 | 12 你做同位素的胶应该有一套dedicated的gel apparatus吧。。。你老板现在有钱,让他
给买!
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 多谢!我最初的想法是我run free protein都能入胶,加上RNA应该更方便,不过也许 : 未必。用agarose gel能做radio吗?PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里,不用太担心 : P32 contaminate gel casette。 : 我的RNA是2'-F modified,通常没有degradation的问题。 : and最后的最后,我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死 : 用我的system free RNA就不入胶。。。
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a****k 发帖数: 1130 | 13 可以做,不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。
如果你一定要用玻璃板,其实我们也试着把agarose配进PAGE里面,不过这样胶会比较
沉,很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶
还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的,所以我在想
或许是有什么secondery structure形成吧,比较你的probe也是经过gel purify的了,
应该不会有别的问题。还是换一个running system吧
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 多谢!我最初的想法是我run free protein都能入胶,加上RNA应该更方便,不过也许 : 未必。用agarose gel能做radio吗?PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里,不用太担心 : P32 contaminate gel casette。 : 我的RNA是2'-F modified,通常没有degradation的问题。 : and最后的最后,我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死 : 用我的system free RNA就不入胶。。。
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w******e 发帖数: 1187 | 14 我们PAGE system是有专做radio的,别人做gel shift都用PAGE没问题,就我比较
衰(当然别人做的都是DNA,挺多步骤不太一样)。
我先试试换buffer成不成吧。多谢啦!
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你做同位素的胶应该有一套dedicated的gel apparatus吧。。。你老板现在有钱,让他 : 给买!
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w******e 发帖数: 1187 | 15 嗯,多谢几位的建议!我要是有好消息回头给大家update一下呵呵。
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 可以做,不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。 : 如果你一定要用玻璃板,其实我们也试着把agarose配进PAGE里面,不过这样胶会比较 : 沉,很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶 : 还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的,所以我在想 : 或许是有什么secondery structure形成吧,比较你的probe也是经过gel purify的了, : 应该不会有别的问题。还是换一个running system吧
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a********n 发帖数: 844 | 16 如果lz在讲附上的胶,我的看法是:
1.上面那个带是well里边滞留的,下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
曝光时间不够长。我做过无数EMSA,也是RNA aptamer,RNA 从MAXIscript得到后不用
纯化,直接取1 ul去跑denaturing gel,看看有没有transcripts,产量有可能因为变
化的,所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪,在这上面浪费了几个星期,一直以
为是这个那个仪器不好用。
2.lz提到protine minus也有多条带,这在native gel里边太正常了,因为RNA有多种
folding的可能性,即使mfold只给出一种结构,我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
性的带可能跟RNA一下带superimpose,但是你会看到下边一条带变弱,上面一条带变强
,这样你要换种浓度的胶跑跑。
3.制胶和电泳液可以用1/4xTBE或者1/2xTGB,前者我用的比较多,这个每个蛋白性质有
关,一般都要试试。
4.ARGA胶有些时候可以替代page,想B52的RNA APTAMER只能在ARGA胶才能看到shift,
原因不明。 |
a********n 发帖数: 844 | 17 BTW,原来lz是标记RNA,我用的是internal labeling,省事多了,一个in vitro
transcription就搞定,不要照搬label DNA 那一套 |
w******e 发帖数: 1187 | 18 internal labeling是指用比如带biotin的NTP做in vitro xcription吗?
如果是,用哪种NTP呢?麻烦展开说说:)
【在 a********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : BTW,原来lz是标记RNA,我用的是internal labeling,省事多了,一个in vitro : transcription就搞定,不要照搬label DNA 那一套
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w******e 发帖数: 1187 | 19 又遇到行家了,多谢啊!多问几个问题呵呵
我的RNA都做过PAGE purification,产物方面应该没问题。
你说free CTP我没理解。看你下一个回复,是不是不用radio用的其他方法?
嗯我也听说过这种情况但自己没见过。不知道出现这种情况的时候怎么计算percentage
of bound RNA呢?把所有band加起来作为total?另外,怎么说服别人某个band是
complex band其他都是free RNA呢?
第二次被提醒buffer的问题了。一定要试试。多谢!
真没用过这个。多谢建议。
【在 a********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果lz在讲附上的胶,我的看法是: : 1.上面那个带是well里边滞留的,下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶 : 曝光时间不够长。我做过无数EMSA,也是RNA aptamer,RNA 从MAXIscript得到后不用 : 纯化,直接取1 ul去跑denaturing gel,看看有没有transcripts,产量有可能因为变 : 化的,所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪,在这上面浪费了几个星期,一直以 : 为是这个那个仪器不好用。 : 2.lz提到protine minus也有多条带,这在native gel里边太正常了,因为RNA有多种 : folding的可能性,即使mfold只给出一种结构,我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异 : 性的带可能跟RNA一下带superimpose,但是你会看到下边一条带变弱,上面一条带变强 : ,这样你要换种浓度的胶跑跑。
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a********n 发帖数: 844 | 20 用alpha-CTP,不是gamma-ATP,alpha-UTP也行,不过差点。
RNA in vitro transcription 用Applied biosystems的Maxiscript足矣
biotin没有试过,下来准备试试,可以避免用同位素。 |
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a********n 发帖数: 844 | 21 多条带的情况下如果要做binding curve,建议用filter-binding assay,默认有几个高
蛋白浓度intensity不变,证明所有RNA都结合蛋白被滞留在filter上,所以那个total
RNA,其他浓度下的intensity都除以这个高浓度的。
有个paper里可以见到你碰到的多条带问题,和两种不同的胶和不同的buffer,给你发
邮件。 |
w******e 发帖数: 1187 | 22 明白了。好奇问一下,如果xcription时就加radio的话,你们接下来的
phenol/PAGE/elute都在radio room里做吗?感觉确实有点吓人呵呵。
不过这样每个xcript有多个radio label,intensity一定够了:)
遗憾我要用2'-F pyrimidine,只能用epicenture的kit。还是要多谢推荐!
【在 a********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用alpha-CTP,不是gamma-ATP,alpha-UTP也行,不过差点。 : RNA in vitro transcription 用Applied biosystems的Maxiscript足矣 : biotin没有试过,下来准备试试,可以避免用同位素。
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w******e 发帖数: 1187 | 23 我用filter binding 做过一次了,老板非要用其他方法confirm。。。
and我filter binding做出来的protein bound RNA plateau时只有20%,怀疑是
aptamer有多种conformation,不过也是老板不爽的原因呵呵。
total
非常感谢!
【在 a********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多条带的情况下如果要做binding curve,建议用filter-binding assay,默认有几个高 : 蛋白浓度intensity不变,证明所有RNA都结合蛋白被滞留在filter上,所以那个total : RNA,其他浓度下的intensity都除以这个高浓度的。 : 有个paper里可以见到你碰到的多条带问题,和两种不同的胶和不同的buffer,给你发 : 邮件。
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a********n 发帖数: 844 | 24 所以说不要胶纯化radioactive RNA,创造太多机会污染实验室了。我们几年来就在实验
室里边一个公用实验台做radioactive的东西,没有发生污染,连专用的高速离心机都
不需要,就需要一个小小的甩甩管壁上的东西。filter binding的前提是EMSA没问题,
有特意的带,你得把EMSA做出正常的结果才行。 |
w******e 发帖数: 1187 | 25 明白了。多谢建议!:)
【在 a********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 所以说不要胶纯化radioactive RNA,创造太多机会污染实验室了。我们几年来就在实验 : 室里边一个公用实验台做radioactive的东西,没有发生污染,连专用的高速离心机都 : 不需要,就需要一个小小的甩甩管壁上的东西。filter binding的前提是EMSA没问题, : 有特意的带,你得把EMSA做出正常的结果才行。
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w******e 发帖数: 1187 | 26 update一下,根据版上几位铜锈的意见换了buffer,果然以前probe都没有入胶(
still don't know why though, as I use 1XTBE all the time),然后很ft的
发现protein target要加到上百nM才能看到shift,然后成linear上升-_-
最后换了SPR,结果跟filter binding一致,low nM Kd。但是EMSA为什么没
work还是不清楚,急着wrap up project也就没多试其他buffer/gel system
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 明白了。多谢建议!:)
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T**********t 发帖数: 1604 | 27 SPR能confirm就行了。
我是SPR没法confirm结果去做了ITC的。:D
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : update一下,根据版上几位铜锈的意见换了buffer,果然以前probe都没有入胶( : still don't know why though, as I use 1XTBE all the time),然后很ft的 : 发现protein target要加到上百nM才能看到shift,然后成linear上升-_- : 最后换了SPR,结果跟filter binding一致,low nM Kd。但是EMSA为什么没 : work还是不清楚,急着wrap up project也就没多试其他buffer/gel system
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