F*****e
发帖数: 182 | 1 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 Trizol肯定work, 那个kit没用过，估计也不会有问题，
抽RNA属于比较简单的活。
那个RNAlater据说很牛，没用过。Seq结果啥叫有多可信？
bias肯定有，基本和realtime一致
seqencing。
【在 F*****e 的大作中提到】
: 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
: 在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
: PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
: Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
: 可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
: 另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。
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e*****t
发帖数: 642 | 3 rna seq比array可靠性要高很多，前提是reads的数量比较大。
而且如果你能做bioinfo的话，有很多数据可以挖。 |
F*****e
发帖数: 182 | 4 主要是想定量分析，看看哪些基因表达水平在wt和mu之间发生变化，寻找机制。 |
e*****t
发帖数: 642 | 5 既然都做了rnaseq了，expression diff只是很多数据挖掘中的一个topic，要不然做
array就可以了 |
F*****e
发帖数: 182 | 6 大家是提取total RNA后就交给facility做后面的呢？还是自己做library？我们的
sample可能比较多，老板希望自己做library。 |
D*a
发帖数: 6830 | 7 你们拿到genotype要用多长时间阿？有没有快一点儿的方法分享下？ |
e*****t
发帖数: 642 | 8 give your whole RNA extraction to seq facility for library preparation. it's
tedious to do it by yourself.if you have time, spend more time on
downstream bioinfo. that would earn you more no matter in publication or job
hunting in the future.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 大家是提取total RNA后就交给facility做后面的呢？还是自己做library？我们的
: sample可能比较多，老板希望自己做library。
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e*****t
发帖数: 642 | 9 you want early? push the seq facility harder if your boss is strong enough.
hehe
【在 D*a 的大作中提到】
: 你们拿到genotype要用多长时间阿？有没有快一点儿的方法分享下？
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D*a
发帖数: 6830 | 10 我说genotype，不是seq
.
【在 e*****t 的大作中提到】
: you want early? push the seq facility harder if your boss is strong enough.
: hehe
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e*****t
发帖数: 642 | 11 it's hard to answer your question if you don't provide details.
how many snps you are going to genotype? are u using array for genome wide
or taqman for a few snps?
【在 D*a 的大作中提到】
: 我说genotype，不是seq
:
: .
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s******s
发帖数: 13035 | 12 看有没有钱，样品多少了。我们实验室自己有tech配试剂自己做，
隔壁实验室一个postdoc有时候也做一两个lane, 据说经常跑不出，
有1/3的概率浪费一个lane
【在 F*****e 的大作中提到】
: 大家是提取total RNA后就交给facility做后面的呢？还是自己做library？我们的
: sample可能比较多，老板希望自己做library。
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D*a
发帖数: 6830 | 13 晕，这个genotype不是普通的mutant还是wt的genotype么？
我以为是lz要看看mutant是不是影响某些rna，可能我理解错了吧
【在 e*****t 的大作中提到】
: it's hard to answer your question if you don't provide details.
: how many snps you are going to genotype? are u using array for genome wide
: or taqman for a few snps?
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F*****e
发帖数: 182 | 14 genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
离心取上清
直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
mechanism
啊。
做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？
【在 D*a 的大作中提到】
: 晕，这个genotype不是普通的mutant还是wt的genotype么？
: 我以为是lz要看看mutant是不是影响某些rna，可能我理解错了吧
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D******t
发帖数: 79 | 15 RNAlater works good for me, although some people started to argue against it
.
For mRNA Deep sequencing, I extracted the 200bp band and purify the band
myself. It works good. |
s******s
发帖数: 13035 | 16 看protocol简单不等于你上手就能成功。要记住，一旦不work
就废了flow cell的一条lane，所以做三五个的还是让别人做吧
【在 F*****e 的大作中提到】
: genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
: 离心取上清
: 直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
: 今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
: 我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
: mechanism
: 啊。
: 做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
: 两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？
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s******r
发帖数: 2876 | 17 提RNA的kit不贵，你完全可以全部都提，
等genotype结果出来吧不要的扔掉。
准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA
seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。
【在 F*****e 的大作中提到】
: 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
: 在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
: PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
: Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
: 可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
: 另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。
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D*a
发帖数: 6830 | 18 那跟我们用的也快不了多少，不换了
多谢～
最近看见一个快速genotype的kit广告，打算去要来试试
【在 F*****e 的大作中提到】
: genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
: 离心取上清
: 直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
: 今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
: 我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
: mechanism
: 啊。
: 做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
: 两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？
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F*****e
发帖数: 182 | 19 大家得到sequence结果怎么分析？是找facility做么？这个需要很强的经验吧。 |
e*****t
发帖数: 642 | 20 qPCR? shouldn't be very hard.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 大家得到sequence结果怎么分析？是找facility做么？这个需要很强的经验吧。
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M*****e
发帖数: 279 | 21 RNALater did not work for me when I extracted total RNA from my mouse (thin)
tissues that were snap frozen in liquid nitrogen, stored frozen, and ground or pulverized while it was frozen.
Without RNALater treatment and storage of mouse tissue in RNALater, I got
perfect total RNA from mouse tissues using the same RNA extraction method.
The quality of total RNA extracted from RNALater treated mouse tissues may
look good by NanoDrop. However, the quality is actually bad when it is
checked by Agilent or BioRad Bioanalyzer in my hands. Bioanalyzer's data is more
reliable and valid. That's why microarray core facility routinely checks
your RNA quality before cDNA microarray is performed.
RNALater dehydrates your tissue and makes it hard to grind or pulverize. |
