c********d
发帖数: 75 | 1 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
好的办法就是
做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
directed
mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
己做克
隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？ |
e****s
发帖数: 1125 | 2 我老板也不喜欢那个Kit。
一个点突变为什么要从提RNA重新开始？
两个建议，
用Kit，Sequence 整个vector.
通过PCR纠正，通常1-2轮PCR就好了，这样PCR的只是目标CDNA的区域了。如果能找到唯
一的internal site就更好了。
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
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m******5
发帖数: 1383 | 3 从早上提RNA，下午逆转录，晚上pcr上走人，第二天早上收货……不需要多少时间啊 |
z********i
发帖数: 610 | 4
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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z********i
发帖数: 610 | 5 可以换一种方法做突变，只针对CDS做PCR， 两次PCR就可以了。
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
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: directed
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: 己做克
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b******n
发帖数: 4225 | 6 很容易啊，还是突变（=表示cDNA部分，*表示突变位点）
-> <-*-
=========================
-*-> <-
两对引物，两轮PCR，（第二轮用引物对->和<-）
克隆回原来载体，测序cDNA部分就行
不过我还是觉得抽RNA反转录可能快点（如果别人有现成的cDNA那就更快了）
【在 c********d 的大作中提到】
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: 好的办法就是
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: 己做克
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j****x
发帖数: 1704 | 7 1. 突变位点两端找两个最近的酶切位点，site directed mutagenesis（QuikChange
method）之后把这个片段切下来替换原来的质粒上的错误序列。测序验证这个片段排除
引入新突变的可能性。
2. Clonetech Transformer Site-Directed Mutagenesis strategy, PCR free method
，所以基本不必担心会引入新突变的问题。
BTW，就算vector因为太长引入了新突变，关系很大吗？cDNA克隆没事不就完了？
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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c********d
发帖数: 75 | 8 前面还有杀老鼠（还是特殊发育期的老鼠，我得等老鼠），后面有pcr产物胶提，放载
体里。其他的
跟突变pcr差不多。
突变pcr呢只要做个pcr，后面transformation什么的都一样。
时间多一些，步骤多一些，出错机会就会多一些。关键是不知道这个片段是不是容易
pcr出来。
【在 m******5 的大作中提到】
: 从早上提RNA，下午逆转录，晚上pcr上走人，第二天早上收货……不需要多少时间啊
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n***w
发帖数: 2405 | |
a***a
发帖数: 40617 | 10 这种sb怎么当上老板的？
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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s****9
发帖数: 932 | 11 My mentor will never give such a detailed suggestion. As long as you get
can the right clone with proper control, he is fine with any resolution.
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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b*******H
发帖数: 830 | 12 SOEing
【在 z********i 的大作中提到】
: 可以换一种方法做突变，只针对CDS做PCR， 两次PCR就可以了。
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c********d
发帖数: 75 | 13 我从前的老板是这样的，现在这个技术上不是大牛还喜欢控制一切细节，凡有未经他同
意的改动都会让他勃然大怒。所以我的问题是碰到这样的老板怎么办。
【在 s****9 的大作中提到】
: My mentor will never give such a detailed suggestion. As long as you get
: can the right clone with proper control, he is fine with any resolution.
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c********d
发帖数: 75 | 14 谢谢大家的建议，我觉得提的这些技术都很好使，应该都可以解决我的问题。有时候觉
得做research的一个乐趣在解决问题，而一个痛苦则在于一定要用一个我不喜欢的方式
去解决（而且还不一定能解决）。 |
y***i
发帖数: 11639 | 15 不能在突变位点两边找到适当的位点切一下么？怎么都不需要把8kb都pcr吧。
我要是你就偷偷做了，一下子就完成的cloning。
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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i***l
发帖数: 1656 | 16 对这样的老板 你就别总告诉他这么具体的细节 没有细节 他也无从 MicroManagement了
自己闷声做呗 做出来了 把结果Show给他就完了
【在 c********d 的大作中提到】
: 我从前的老板是这样的，现在这个技术上不是大牛还喜欢控制一切细节，凡有未经他同
: 意的改动都会让他勃然大怒。所以我的问题是碰到这样的老板怎么办。
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c********d
发帖数: 75 | 17 从前可以，现在不行了，他会要看实验记录，对于不听从他指挥的做法定性为
communication有严重问题，performance不好。很难相处啊。都想马上不干了，但是下
家还没找到呢。版上有人要没？
【在 y***i 的大作中提到】
: 不能在突变位点两边找到适当的位点切一下么？怎么都不需要把8kb都pcr吧。
: 我要是你就偷偷做了，一下子就完成的cloning。
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a*******u
发帖数: 2 | 18 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
m******5
发帖数: 1383 | 19 8kb?? 是从genomic DNA还是cDNA p？
【在 a*******u 的大作中提到】
: 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
: 还是说没有普遍性？因基因而异？
: 我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
: 这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
: 功。我们用的是LA Taq。
: 请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
: 试剂盒。
: 另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
: 大家遇到这种情况是怎么解决的呢？
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A******d
发帖数: 571 | 20 这老板台可怕了
你是薄厚？快照下家
【在 c********d 的大作中提到】
: 从前可以，现在不行了，他会要看实验记录，对于不听从他指挥的做法定性为
: communication有严重问题，performance不好。很难相处啊。都想马上不干了，但是下
: 家还没找到呢。版上有人要没？
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w******n
发帖数: 767 | 21 用质量好的酶，8kb完全没问题，我做过几十个这样的突变纠正。
【在 c********d 的大作中提到】
: 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
: 好的办法就是
: 做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
: directed
: mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
: 己做克
: 隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？
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b******n
发帖数: 4225 | 22 nod，Stratagene PfuUltra DNA polymerase 是个很好的选择
【在 w******n 的大作中提到】
: 用质量好的酶，8kb完全没问题，我做过几十个这样的突变纠正。
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j****x
发帖数: 1704 | 23 问题不在于好酶是否能够纠正突变，而在于你如何排除引入新的突变。即便理论上这样的
几率不大，但是为了确保万无一失，一般还是需要全长测序验证的。8kb，至少也是10
个反
应，时间，成本，都是问题了
【在 w******n 的大作中提到】
: 用质量好的酶，8kb完全没问题，我做过几十个这样的突变纠正。
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j****x
发帖数: 1704 | 24 laf...
看了后面的帖子才知道你压根就没用过这个酶，你也真靠谱...
【在 b******n 的大作中提到】
: nod，Stratagene PfuUltra DNA polymerase 是个很好的选择
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b******n
发帖数: 4225 | 25 用过pfuUltra，但是新出来一个pfuUltra和fusion的结合体心里没谱
【在 j****x 的大作中提到】
: laf...
: 看了后面的帖子才知道你压根就没用过这个酶，你也真靠谱...
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l*****8
发帖数: 770 | 26 赶紧找，我以前也碰到过这种沙蔽， 很难交流，什么都想控制。
【在 c********d 的大作中提到】
: 从前可以，现在不行了，他会要看实验记录，对于不听从他指挥的做法定性为
: communication有严重问题，performance不好。很难相处啊。都想马上不干了，但是下
: 家还没找到呢。版上有人要没？
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