a*******u
发帖数: 2 | 1 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
j****x
发帖数: 1704 | |
R******n
发帖数: 33 | 3 从基因组DNA里面分段扩exon然后拼起来 ：） |
S******e
发帖数: 393 | 4 我是这样做的：从公司买的cDNA（这样可以保证质量），好像也不贵，
然后用pfu（pfu from invitrogen or NEB，记不清了，两家都用过），
扩了两个4kb,测序，然后拼接为8kb的片段。 |
c******r
发帖数: 3778 | 5 自己拼啊。
关键看你想干嘛。
如果想克隆出来慢慢玩儿，8kb，两段要是不行，分3段，4段怎么都可以了啊。不要用
random primer，用自己design几个primers也没多麻烦。顺利的话两个礼拜，不顺利一
两个月怎么也可以了。
如果需要很多samples拿来测序，一次扩也可以，但是要摸条件，RT需要调整protocol
，否则拿不到那么长的cDNA。慢慢试啦，不一定100%都可以成功，但是也不是不可能啦
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