S******e
发帖数: 393 | 1 假如蛋白A(400kD)和蛋白B(40kD)有binding,
那么在做pulldown时，是否会大蛋白拉小蛋白容易，而小蛋白拉大蛋白难些呢？
还是根本没区别,不受大小影响呢？
THX! |
D***a
发帖数: 516 | 2 我也借机问个问题：假设说蛋白A的C末端10aa与蛋白B结合，我用的IP抗体也是识别A蛋
白C末端10aa的，那我用这个抗体能拉下来AB复合物吗？ |
m******5
发帖数: 1383 | 3 我遇到过这个问题
AB已知有相互作用，我第一次用GST fusion A N terminal 拉B，怎么拉也拉不下来，
strigency多低也不行
后来用N-terminal fusion B拉A，相互作用非常强，结果用靠马斯亮蓝就能做得很
convincing
所以我觉得不管是什么情况， 如何才能做出来都是不一定的
你的case我觉得拉不下来，这几乎是很reasonable的-_-
【在 D***a 的大作中提到】
: 我也借机问个问题：假设说蛋白A的C末端10aa与蛋白B结合，我用的IP抗体也是识别A蛋
: 白C末端10aa的，那我用这个抗体能拉下来AB复合物吗？
|
S******e
发帖数: 393 | 4 你的结果不是说明了binding site 在B的N-terminal，A的C-terminal吗？
你觉得二楼的case拉不下来是因为竞争？
请指教.
【在 m******5 的大作中提到】
: 我遇到过这个问题
: AB已知有相互作用，我第一次用GST fusion A N terminal 拉B，怎么拉也拉不下来，
: strigency多低也不行
: 后来用N-terminal fusion B拉A，相互作用非常强，结果用靠马斯亮蓝就能做得很
: convincing
: 所以我觉得不管是什么情况， 如何才能做出来都是不一定的
: 你的case我觉得拉不下来，这几乎是很reasonable的-_-
|
m******5
发帖数: 1383 | 5 不能说明这个问题
实际上，binding domain在这两个蛋白的中部
是的，我觉得是竞争，实际上很多文章哟国内已知识别某个特殊binding位点的抗体转
入细胞disrupt特定相互作用
【在 S******e 的大作中提到】
: 你的结果不是说明了binding site 在B的N-terminal，A的C-terminal吗？
: 你觉得二楼的case拉不下来是因为竞争？
: 请指教.
|
S******e
发帖数: 393 | 6 你的case: 用GST-A 拉不下来B，反过来可以，你觉得是什么原因？
又不能说是抗体的原因，用的都是GST。
我的情况： IP A 可以检测到B(信号还算强)； IP B 检测不到A(或非常弱)，
因为用的抗体不同，所以暂不能排除抗体因素，需要重复。
【在 m******5 的大作中提到】
: 不能说明这个问题
: 实际上，binding domain在这两个蛋白的中部
: 是的，我觉得是竞争，实际上很多文章哟国内已知识别某个特殊binding位点的抗体转
: 入细胞disrupt特定相互作用
|
m******5
发帖数: 1383 | 7 我怀疑是GST fusion引起的artificial作用
nobody knows
事后看别的文献发现也无一例外follow 另一种拉法，看来是个unwritten rule for
this context
【在 S******e 的大作中提到】
: 你的case: 用GST-A 拉不下来B，反过来可以，你觉得是什么原因？
: 又不能说是抗体的原因，用的都是GST。
: 我的情况： IP A 可以检测到B(信号还算强)； IP B 检测不到A(或非常弱)，
: 因为用的抗体不同，所以暂不能排除抗体因素，需要重复。
|
m******5
发帖数: 1383 | 8 我觉得你的case 最重要的是map出相互作用位点
用缺失相互作用位点的蛋白作阴性对照
反拉本来就是不一定能拉出来的，原因太多了
【在 S******e 的大作中提到】
: 你的case: 用GST-A 拉不下来B，反过来可以，你觉得是什么原因？
: 又不能说是抗体的原因，用的都是GST。
: 我的情况： IP A 可以检测到B(信号还算强)； IP B 检测不到A(或非常弱)，
: 因为用的抗体不同，所以暂不能排除抗体因素，需要重复。
|
S******e
发帖数: 393 | 9 多谢，还在做，已经mapping到了某一区段，
但是不知如何在100多个氨基酸里找critical residues, 你有什么建议么？
下面也准备重复reverse IP, 希望做出来。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我觉得你的case 最重要的是map出相互作用位点
: 用缺失相互作用位点的蛋白作阴性对照
: 反拉本来就是不一定能拉出来的，原因太多了
|
