f*******e
发帖数: 354 | 1 做了个flag-tag fusion protein，在293 transient transfection, 用蛋白本身的抗
体检测是一大坨，q-pcr 表达也是有几十倍的升高。
但是就是用M2 beads IP不下来或者极少。
然后用flag 抗体检测，居然多次检测不到。最后是在疯狂一下地翻了10倍的二抗量 膜
都要压爆了才压出来条带正确的带，大小正确，量也与基因本身的抗体显示的量对应。
这在本实验室在293瞬转检测中似乎从来没有遇到过。
难道是flag跟我的蛋白在一起就难以检测？ 甚至在denature gel中？
那在nature状态下更难结合？所以IP失败？
求教，
非常感谢 |
t******y
发帖数: 716 | 2 不同的蛋白表现不同。你这个蛋白是在哪里表达的？Flag在C末端还是N末端，如果是N
末端，是否存在信号肽，通常信号肽在表达过程中会被切除。还有一种情况是M2抗体对
位于N末端的Flag识别效率远远超过位于C末端的Flag，是否可以把Flag放到N末端。 |
f*******e
发帖数: 354 | 3 flag在N端。
后面接着蛋白自己的M，但是既然可以检测到，所以flag还在啊。
谢谢 |
f*******e
发帖数: 354 | 4 flag在N端。
后面接着蛋白自己的M，但是既然可以检测到，所以flag还在啊。
谢谢 |
t******y
发帖数: 716 | 5 如果蛋白N端有信号肽，Flag连着信号肽，信号肽的切除不是100%，但也是绝大多数，
如果碰到这种情况检测不到就很正常了。或者下次你用MG132来抑制蛋白降解。看看目
标蛋白的量是否上去。
【在 f*******e 的大作中提到】
: flag在N端。
: 后面接着蛋白自己的M，但是既然可以检测到，所以flag还在啊。
: 谢谢
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f*******e
发帖数: 354 | 6 信号肽的切除是蛋白酶体途径？ 我不懂这个
怎么看是否有信号肽，预测？或有特征氨基酸谱？
谢谢
【在 t******y 的大作中提到】
: 如果蛋白N端有信号肽，Flag连着信号肽，信号肽的切除不是100%，但也是绝大多数，
: 如果碰到这种情况检测不到就很正常了。或者下次你用MG132来抑制蛋白降解。看看目
: 标蛋白的量是否上去。
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f*******e
发帖数: 354 | 7 信号肽的切除是蛋白酶体途径？ 我不懂这个
怎么看是否有信号肽，预测？或有特征氨基酸谱？
谢谢
【在 t******y 的大作中提到】
: 如果蛋白N端有信号肽，Flag连着信号肽，信号肽的切除不是100%，但也是绝大多数，
: 如果碰到这种情况检测不到就很正常了。或者下次你用MG132来抑制蛋白降解。看看目
: 标蛋白的量是否上去。
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t******y
发帖数: 716 | 8 一般在内质网，细胞表面表达的蛋白有信号肽。可以用signal peptide prediction软
件查询。通常信号肽都是一下疏水性的氨基酸组成，譬如大量的亮氨酸，L。 |
