l***g 发帖数: 19 | 1 如果蛋白A和蛋白B结合,用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性,但是如果用A-His6就检测
不到B-His6酶活性的上升,所以我的问题是,A-His6和B-His6也能结合吗,会不会由于
His6带有正电,两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。 |
t**m 发帖数: 158 | 2 his-tag的A有表达吗?
【在 l***g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果蛋白A和蛋白B结合,用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体 : 外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性,但是如果用A-His6就检测 : 不到B-His6酶活性的上升,所以我的问题是,A-His6和B-His6也能结合吗,会不会由于 : His6带有正电,两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。
|
l***g 发帖数: 19 | 3 表达很好,表达量比GST tag的A还多。
【在 t**m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : his-tag的A有表达吗?
|
e****s 发帖数: 1125 | 4 为什么要纠缠另一个tag呢?你这个Tag换了,N,C融合位点也换了!
要担心Tag的影响,把GST切了,看对B的活性是否有促进不是更有说服力?
【在 l***g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果蛋白A和蛋白B结合,用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体 : 外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性,但是如果用A-His6就检测 : 不到B-His6酶活性的上升,所以我的问题是,A-His6和B-His6也能结合吗,会不会由于 : His6带有正电,两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。
|
l***g 发帖数: 19 | 5 也试过切gst,但是切后纯化,再去掉factor xa,所得到的蛋白实在太少了,想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶,用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍,还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了,别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的,但是合作的实验室就非
要去掉tag,或者用his的,就为这点事情耽误了快2个月了,急死我了,实验就差最后
这一个了
【在 e****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 为什么要纠缠另一个tag呢?你这个Tag换了,N,C融合位点也换了! : 要担心Tag的影响,把GST切了,看对B的活性是否有促进不是更有说服力?
|
W*********e 发帖数: 247 | 6 GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解
也试过切gst,但是切后纯化,再去掉factor xa,所得到的蛋白实在太少了,想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶,用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍,还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了,别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的,但是合作的实验室就非
要去掉tag,或者用his的,就为这点事情耽误了快2个月了,急死我了,实验就差最后
这一个了
【在 l***g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也试过切gst,但是切后纯化,再去掉factor xa,所得到的蛋白实在太少了,想用 : precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶,用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又 : 比pGEX5的少了好几倍,还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了,别的文献上 : 都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的,但是合作的实验室就非 : 要去掉tag,或者用his的,就为这点事情耽误了快2个月了,急死我了,实验就差最后 : 这一个了
|