l***g
发帖数: 19 | 1 如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。 |
t**m
发帖数: 158 | 2 his-tag的A有表达吗?
【在 l***g 的大作中提到】
: 如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
: 外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
: 不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
: His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。
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l***g
发帖数: 19 | 3 表达很好，表达量比GST tag的A还多。
【在 t**m 的大作中提到】
: his-tag的A有表达吗?
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e****s
发帖数: 1125 | 4 为什么要纠缠另一个tag呢？你这个Tag换了，N,C融合位点也换了！
要担心Tag的影响，把GST切了，看对B的活性是否有促进不是更有说服力？
【在 l***g 的大作中提到】
: 如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
: 外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
: 不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
: His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。
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l***g
发帖数: 19 | 5 也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了
【在 e****s 的大作中提到】
: 为什么要纠缠另一个tag呢？你这个Tag换了，N,C融合位点也换了！
: 要担心Tag的影响，把GST切了，看对B的活性是否有促进不是更有说服力？
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W*********e
发帖数: 247 | 6 GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解
也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了
【在 l***g 的大作中提到】
: 也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
: precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
: 比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
: 都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
: 要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
: 这一个了
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