t*****z
发帖数: 1598 | 1 各位同仁，
本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
以达到纯化和增强目标产物的目的？
两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
多谢大家！ |
m*****y
发帖数: 857 | 2 you answered yourself. use nested pcr
呢？
【在 t*****z 的大作中提到】
: 各位同仁，
: 本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
: 以达到纯化和增强目标产物的目的？
: 两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
: 当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
: 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
: 。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
: 物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
: 在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
: 法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
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m**********2
发帖数: 6568 | 3 NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
period.
end of discussion.
don't even think about it.
just remember.
呢？
【在 t*****z 的大作中提到】
: 各位同仁，
: 本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
: 以达到纯化和增强目标产物的目的？
: 两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
: 当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
: 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
: 。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
: 物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
: 在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
: 法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
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t*****z
发帖数: 1598 | 4 谢谢你的指点！你能告诉我原因吗？我自己觉得，使用原始引物做第二轮PCR，就相当
于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂，按理说应该是可行的。结果不好，想必有什么
我不知道的生化上的道理吧。很想知道，能说一下吗？
【在 m**********2 的大作中提到】
: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？
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t*****z
发帖数: 1598 | 5 我现在的实验结果，如果第二轮两边引物都用原始引物，则成功率较低，不过还是有一
些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物，则成功率很高。两个都
用巢式引物自然也能成功。
我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物，毕竟有些费钱费时，如果
能借助现有的材料做出来，自然最好不过了。可不知有什么好办法。 |
m*****y
发帖数: 857 | 6 do a gel band purification after your first round PCR
【在 t*****z 的大作中提到】
: 我现在的实验结果，如果第二轮两边引物都用原始引物，则成功率较低，不过还是有一
: 些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物，则成功率很高。两个都
: 用巢式引物自然也能成功。
: 我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物，毕竟有些费钱费时，如果
: 能借助现有的材料做出来，自然最好不过了。可不知有什么好办法。
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D*a
发帖数: 6830 | 7 我试过用一端相同一端巢式的，效率挺高的。
但是我只是为了测序，测序完了就没有下一步了，测序结果很干净。但是不知道lz如果
还想干别的效果如何。
同想听听是什么道理。 |
g***j
发帖数: 40861 | 8 me too
【在 D*a 的大作中提到】
: 我试过用一端相同一端巢式的，效率挺高的。
: 但是我只是为了测序，测序完了就没有下一步了，测序结果很干净。但是不知道lz如果
: 还想干别的效果如何。
: 同想听听是什么道理。
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m**********2
发帖数: 6568 | 9 no need to think about.
all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.
【在 t*****z 的大作中提到】
: 谢谢你的指点！你能告诉我原因吗？我自己觉得，使用原始引物做第二轮PCR，就相当
: 于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂，按理说应该是可行的。结果不好，想必有什么
: 我不知道的生化上的道理吧。很想知道，能说一下吗？
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w******n
发帖数: 767 | 10 做过几次，没遇到这样的问题。
呢？
【在 t*****z 的大作中提到】
: 各位同仁，
: 本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
: 以达到纯化和增强目标产物的目的？
: 两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
: 当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
: 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
: 。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
: 物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
: 在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
: 法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
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t*****z
发帖数: 1598 | 11 这位朋友，你的论断与事实不符。
not
【在 m**********2 的大作中提到】
: no need to think about.
: all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
: here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.
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A********0
发帖数: 3310 | 12 use nested PCR or
semi-nested "用一端相同一端巢式的" |
A********0
发帖数: 3310 | 13 In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles
while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never
tried it.
Good luck & Happy thanksgiving. |
s******a
发帖数: 472 | 14 感觉有时候可以，有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥？
【在 m**********2 的大作中提到】
: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？
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s******a
发帖数: 472 | 15 感觉有时候可以，有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥？
【在 m**********2 的大作中提到】
: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？
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t*****z
发帖数: 1598 | 16 这个想法听上去不错啊，因为模板本身就这么长，单单一个引物没准也能扩增出来，不
会run-off了。哪天我可以试试。
cycles
【在 A********0 的大作中提到】
: In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles
: while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never
: tried it.
: Good luck & Happy thanksgiving.
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A********0
发帖数: 3310 | 17 如果要试，试多几个cycles.
【在 t*****z 的大作中提到】
: 这个想法听上去不错啊，因为模板本身就这么长，单单一个引物没准也能扩增出来，不
: 会run-off了。哪天我可以试试。
:
: cycles
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a*******a
发帖数: 4233 | 18 拿0.几ul产物太多了，0.几ul搞不好ug级别的模板
纯化一下稀释1000倍至10万倍做个梯度试试。
我们pcr有杂带以后切胶纯化目的片段重新pcr没问题的
goodluck |
b********n
发帖数: 57 | 19 是这样的, 如果你第二轮继续用同一对primer的话, 第一轮的nonspecific product
will also be amplified. 所以一般来说, 第二轮应该至少换一个primer. |
w******n
发帖数: 767 | 20 我来给个可能解释吧，
首先，我用第一轮pcr产物做模板没遇到这样的问题，原因可能是上面同学说了，做了
胶回收纯化。
第一轮条带很弱的原因是因为引物特异性不好，那么pcr产物中有很多非特异性的产物
，如果不纯化目的条带，非特异性的产物在第二轮会竞争消耗掉引物，所以仍然得不到
加强的目的产物。
呢？
【在 t*****z 的大作中提到】
: 各位同仁，
: 本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
: 以达到纯化和增强目标产物的目的？
: 两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
: 当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
: 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
: 。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
: 物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
: 在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
: 法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
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z*******9
发帖数: 112 | 21 我也遇到同样的情况，我想，可不可以通过增加第二轮PCR的特异性，例如，升高
anneal tm，个人想法而已，还没有实践过， |
t*****z
发帖数: 1598 | 22 谢谢各位的提议！这两天我又做了一系列实验，试图提高两边都是原始引物的情况的扩
增效率，同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现：延长失活初始时间没用（
我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构）；延长延伸时间没用；增加模板
量有用（条带变深了）；增加反应循环数没用；降低温度没用（用的温度都高于理论Tm
）；增加镁离子没用（反而增加非特异扩增），改变缓冲液的种类没用（比如用Cl和用
SO4的）。我打算试试直接纯化和切胶回收。
大家的提议，我会陆续试试看！ |
m**********2
发帖数: 6568 | 23 why do yu want to do all these?
it is much easier to get another pair of primers.
Tm
【在 t*****z 的大作中提到】
: 谢谢各位的提议！这两天我又做了一系列实验，试图提高两边都是原始引物的情况的扩
: 增效率，同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现：延长失活初始时间没用（
: 我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构）；延长延伸时间没用；增加模板
: 量有用（条带变深了）；增加反应循环数没用；降低温度没用（用的温度都高于理论Tm
: ）；增加镁离子没用（反而增加非特异扩增），改变缓冲液的种类没用（比如用Cl和用
: SO4的）。我打算试试直接纯化和切胶回收。
: 大家的提议，我会陆续试试看！
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d****i
发帖数: 2346 | 24 第一轮产物泡脚，在你目的片段预期大小的位置切胶回收，胶切取的范围可以稍微大一
些，纯化后再做第二轮用梯度PCR。 |
