t*****z 发帖数: 1598 | 1 各位同仁,
本人最近纠结于这个技术问题:怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR,
以达到纯化和增强目标产物的目的?
两轮PCR用的是同样的引物(不是巢式PCR)。本人原先以为,第一轮的PCR产物已经相
当多了,而且和引物百分之百互补,虽然条带暗些,但是稍微拿那么0.几ul出来,怎么
也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意,即便尝试优化条件也不见明显改善
。经过多次试验,我发现用原始引物做第二轮PCR,效率很低,往往失败;而用巢式引
物却几乎都能成功。样本有限,感受未必客观。
在此向请教各位有经验的同仁:用原始引物做第二轮PCR,果真效率很低吗?有什么办
法可以提高这样的PCR的效率呢?什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢?
多谢大家! |
m*****y 发帖数: 857 | 2 you answered yourself. use nested pcr
呢?
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 各位同仁, : 本人最近纠结于这个技术问题:怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR, : 以达到纯化和增强目标产物的目的? : 两轮PCR用的是同样的引物(不是巢式PCR)。本人原先以为,第一轮的PCR产物已经相 : 当多了,而且和引物百分之百互补,虽然条带暗些,但是稍微拿那么0.几ul出来,怎么 : 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意,即便尝试优化条件也不见明显改善 : 。经过多次试验,我发现用原始引物做第二轮PCR,效率很低,往往失败;而用巢式引 : 物却几乎都能成功。样本有限,感受未必客观。 : 在此向请教各位有经验的同仁:用原始引物做第二轮PCR,果真效率很低吗?有什么办 : 法可以提高这样的PCR的效率呢?什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢?
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m**********2 发帖数: 6568 | 3 NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
period.
end of discussion.
don't even think about it.
just remember.
呢?
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 各位同仁, : 本人最近纠结于这个技术问题:怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR, : 以达到纯化和增强目标产物的目的? : 两轮PCR用的是同样的引物(不是巢式PCR)。本人原先以为,第一轮的PCR产物已经相 : 当多了,而且和引物百分之百互补,虽然条带暗些,但是稍微拿那么0.几ul出来,怎么 : 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意,即便尝试优化条件也不见明显改善 : 。经过多次试验,我发现用原始引物做第二轮PCR,效率很低,往往失败;而用巢式引 : 物却几乎都能成功。样本有限,感受未必客观。 : 在此向请教各位有经验的同仁:用原始引物做第二轮PCR,果真效率很低吗?有什么办 : 法可以提高这样的PCR的效率呢?什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢?
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t*****z 发帖数: 1598 | 4 谢谢你的指点!你能告诉我原因吗?我自己觉得,使用原始引物做第二轮PCR,就相当
于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂,按理说应该是可行的。结果不好,想必有什么
我不知道的生化上的道理吧。很想知道,能说一下吗?
【在 m**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : NEVER EVER use the original pair for the 2nd round. : period. : end of discussion. : don't even think about it. : just remember. : : 呢?
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t*****z 发帖数: 1598 | 5 我现在的实验结果,如果第二轮两边引物都用原始引物,则成功率较低,不过还是有一
些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物,则成功率很高。两个都
用巢式引物自然也能成功。
我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物,毕竟有些费钱费时,如果
能借助现有的材料做出来,自然最好不过了。可不知有什么好办法。 |
m*****y 发帖数: 857 | 6 do a gel band purification after your first round PCR
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我现在的实验结果,如果第二轮两边引物都用原始引物,则成功率较低,不过还是有一 : 些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物,则成功率很高。两个都 : 用巢式引物自然也能成功。 : 我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物,毕竟有些费钱费时,如果 : 能借助现有的材料做出来,自然最好不过了。可不知有什么好办法。
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D*a 发帖数: 6830 | 7 我试过用一端相同一端巢式的,效率挺高的。
但是我只是为了测序,测序完了就没有下一步了,测序结果很干净。但是不知道lz如果
还想干别的效果如何。
同想听听是什么道理。 |
g***j 发帖数: 40861 | 8 me too
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我试过用一端相同一端巢式的,效率挺高的。 : 但是我只是为了测序,测序完了就没有下一步了,测序结果很干净。但是不知道lz如果 : 还想干别的效果如何。 : 同想听听是什么道理。
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m**********2 发帖数: 6568 | 9 no need to think about.
all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢你的指点!你能告诉我原因吗?我自己觉得,使用原始引物做第二轮PCR,就相当 : 于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂,按理说应该是可行的。结果不好,想必有什么 : 我不知道的生化上的道理吧。很想知道,能说一下吗?
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w******n 发帖数: 767 | 10 做过几次,没遇到这样的问题。
呢?
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 各位同仁, : 本人最近纠结于这个技术问题:怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR, : 以达到纯化和增强目标产物的目的? : 两轮PCR用的是同样的引物(不是巢式PCR)。本人原先以为,第一轮的PCR产物已经相 : 当多了,而且和引物百分之百互补,虽然条带暗些,但是稍微拿那么0.几ul出来,怎么 : 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意,即便尝试优化条件也不见明显改善 : 。经过多次试验,我发现用原始引物做第二轮PCR,效率很低,往往失败;而用巢式引 : 物却几乎都能成功。样本有限,感受未必客观。 : 在此向请教各位有经验的同仁:用原始引物做第二轮PCR,果真效率很低吗?有什么办 : 法可以提高这样的PCR的效率呢?什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢?
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t*****z 发帖数: 1598 | 11 这位朋友,你的论断与事实不符。
not
【在 m**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : no need to think about. : all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not : here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.
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A********0 发帖数: 3310 | 12 use nested PCR or
semi-nested "用一端相同一端巢式的" |
A********0 发帖数: 3310 | 13 In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles
while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never
tried it.
Good luck & Happy thanksgiving. |
s******a 发帖数: 472 | 14 感觉有时候可以,有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥?
【在 m**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : NEVER EVER use the original pair for the 2nd round. : period. : end of discussion. : don't even think about it. : just remember. : : 呢?
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s******a 发帖数: 472 | 15 感觉有时候可以,有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥?
【在 m**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : NEVER EVER use the original pair for the 2nd round. : period. : end of discussion. : don't even think about it. : just remember. : : 呢?
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t*****z 发帖数: 1598 | 16 这个想法听上去不错啊,因为模板本身就这么长,单单一个引物没准也能扩增出来,不
会run-off了。哪天我可以试试。
cycles
【在 A********0 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles : while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never : tried it. : Good luck & Happy thanksgiving.
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A********0 发帖数: 3310 | 17 如果要试,试多几个cycles.
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个想法听上去不错啊,因为模板本身就这么长,单单一个引物没准也能扩增出来,不 : 会run-off了。哪天我可以试试。 : : cycles
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a*******a 发帖数: 4233 | 18 拿0.几ul产物太多了,0.几ul搞不好ug级别的模板
纯化一下稀释1000倍至10万倍做个梯度试试。
我们pcr有杂带以后切胶纯化目的片段重新pcr没问题的
goodluck |
b********n 发帖数: 57 | 19 是这样的, 如果你第二轮继续用同一对primer的话, 第一轮的nonspecific product
will also be amplified. 所以一般来说, 第二轮应该至少换一个primer. |
w******n 发帖数: 767 | 20 我来给个可能解释吧,
首先,我用第一轮pcr产物做模板没遇到这样的问题,原因可能是上面同学说了,做了
胶回收纯化。
第一轮条带很弱的原因是因为引物特异性不好,那么pcr产物中有很多非特异性的产物
,如果不纯化目的条带,非特异性的产物在第二轮会竞争消耗掉引物,所以仍然得不到
加强的目的产物。
呢?
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 各位同仁, : 本人最近纠结于这个技术问题:怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR, : 以达到纯化和增强目标产物的目的? : 两轮PCR用的是同样的引物(不是巢式PCR)。本人原先以为,第一轮的PCR产物已经相 : 当多了,而且和引物百分之百互补,虽然条带暗些,但是稍微拿那么0.几ul出来,怎么 : 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意,即便尝试优化条件也不见明显改善 : 。经过多次试验,我发现用原始引物做第二轮PCR,效率很低,往往失败;而用巢式引 : 物却几乎都能成功。样本有限,感受未必客观。 : 在此向请教各位有经验的同仁:用原始引物做第二轮PCR,果真效率很低吗?有什么办 : 法可以提高这样的PCR的效率呢?什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢?
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z*******9 发帖数: 112 | 21 我也遇到同样的情况,我想,可不可以通过增加第二轮PCR的特异性,例如,升高
anneal tm,个人想法而已,还没有实践过, |
t*****z 发帖数: 1598 | 22 谢谢各位的提议!这两天我又做了一系列实验,试图提高两边都是原始引物的情况的扩
增效率,同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现:延长失活初始时间没用(
我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构);延长延伸时间没用;增加模板
量有用(条带变深了);增加反应循环数没用;降低温度没用(用的温度都高于理论Tm
);增加镁离子没用(反而增加非特异扩增),改变缓冲液的种类没用(比如用Cl和用
SO4的)。我打算试试直接纯化和切胶回收。
大家的提议,我会陆续试试看! |
m**********2 发帖数: 6568 | 23 why do yu want to do all these?
it is much easier to get another pair of primers.
Tm
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢各位的提议!这两天我又做了一系列实验,试图提高两边都是原始引物的情况的扩 : 增效率,同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现:延长失活初始时间没用( : 我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构);延长延伸时间没用;增加模板 : 量有用(条带变深了);增加反应循环数没用;降低温度没用(用的温度都高于理论Tm : );增加镁离子没用(反而增加非特异扩增),改变缓冲液的种类没用(比如用Cl和用 : SO4的)。我打算试试直接纯化和切胶回收。 : 大家的提议,我会陆续试试看!
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d****i 发帖数: 2346 | 24 第一轮产物泡脚,在你目的片段预期大小的位置切胶回收,胶切取的范围可以稍微大一
些,纯化后再做第二轮用梯度PCR。 |