x***o
发帖数: 47 | 1 有个问题想请教大家一下。做的一个蛋白是酶，结构已经解析出来了，催化肽键断裂。
预测的催化三联体中2个残基出现在活性中心，另外一个残基（x）离活性中心很远，通
过序列比对确定这个远离的残基就是催化三联体之一，很保守。如果是变构结合的话，
我用itc测了好几个底物也看不见结合放热。和已知的同源结构进行结构比对，也发现
那2个残基位置都对应，就是x很不对。我怀疑有没有可能是Zymogen，或者需要啥附因
子之类的激活它。没经验啊，希望大家给点意见，小弟还指望这个毕业呢。多谢多谢 |
l**********1
发帖数: 5204 | 2 if 尿激酶: by small-angle X-ray scattering paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21669207
if 丝氨酸蛋白酶 you also hlod antibody of it,
then try by Surface Plasmon Resonance Analysis (SPR)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19047064
【在 x***o 的大作中提到】
: 有个问题想请教大家一下。做的一个蛋白是酶，结构已经解析出来了，催化肽键断裂。
: 预测的催化三联体中2个残基出现在活性中心，另外一个残基（x）离活性中心很远，通
: 过序列比对确定这个远离的残基就是催化三联体之一，很保守。如果是变构结合的话，
: 我用itc测了好几个底物也看不见结合放热。和已知的同源结构进行结构比对，也发现
: 那2个残基位置都对应，就是x很不对。我怀疑有没有可能是Zymogen，或者需要啥附因
: 子之类的激活它。没经验啊，希望大家给点意见，小弟还指望这个毕业呢。多谢多谢
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x***o
发帖数: 47 | 3 是 Cysteine proteinases，多谢，先看看 |
l**********1
发帖数: 5204 | 4 if cysteine cathepsins
please go to:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20860624
and
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9299326
ps: if you are satisfied with this answer,
BAOZI one please transfer to my mitbbs financial account,
Wei-bi 10.
【在 x***o 的大作中提到】
: 是 Cysteine proteinases，多谢，先看看
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e****s
发帖数: 1125 | 5 没太看明白。
你想研究这个X是不是直接和催化相关？
底物不能结合是WT还是mutants? 确定你的酶是活的吗，有测过WT的酶活吗？特别如果
底物不能结合的话。
【在 x***o 的大作中提到】
: 有个问题想请教大家一下。做的一个蛋白是酶，结构已经解析出来了，催化肽键断裂。
: 预测的催化三联体中2个残基出现在活性中心，另外一个残基（x）离活性中心很远，通
: 过序列比对确定这个远离的残基就是催化三联体之一，很保守。如果是变构结合的话，
: 我用itc测了好几个底物也看不见结合放热。和已知的同源结构进行结构比对，也发现
: 那2个残基位置都对应，就是x很不对。我怀疑有没有可能是Zymogen，或者需要啥附因
: 子之类的激活它。没经验啊，希望大家给点意见，小弟还指望这个毕业呢。多谢多谢
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x***o
发帖数: 47 | 6 嗯，看看，我好像没baozi，俺是新手，对不住了
【在 l**********1 的大作中提到】
: if cysteine cathepsins
: please go to:
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20860624
: and
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9299326
: ps: if you are satisfied with this answer,
: BAOZI one please transfer to my mitbbs financial account,
: Wei-bi 10.
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x***o
发帖数: 47 | 7 x是和底物催化直接相关，wt和mutant都做了，我怀疑可能是结合不紧密造成的。
酶活还没做呢，打算做呢。我想知道如果是结合底物后会造成构象变化，那我怎么确定
呢（复合物估计拿不到，看不到结合），另一个可能如果这个蛋白是酶原的话，我又该
怎么确定。谢谢大家。
【在 e****s 的大作中提到】
: 没太看明白。
: 你想研究这个X是不是直接和催化相关？
: 底物不能结合是WT还是mutants? 确定你的酶是活的吗，有测过WT的酶活吗？特别如果
: 底物不能结合的话。
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d******1
发帖数: 709 | 8 有了结构，复合体不是小case一个么？把晶体浸在底物里面，多来几次，总会看到一片
云的。结合放热并不是每次都能看见的，有些构象变化天生没有热量变化。用NMR，SPR
看看吧。 |
b******n
发帖数: 4225 | 9 有没有这三个残基的点突变结果
【在 x***o 的大作中提到】
: 有个问题想请教大家一下。做的一个蛋白是酶，结构已经解析出来了，催化肽键断裂。
: 预测的催化三联体中2个残基出现在活性中心，另外一个残基（x）离活性中心很远，通
: 过序列比对确定这个远离的残基就是催化三联体之一，很保守。如果是变构结合的话，
: 我用itc测了好几个底物也看不见结合放热。和已知的同源结构进行结构比对，也发现
: 那2个残基位置都对应，就是x很不对。我怀疑有没有可能是Zymogen，或者需要啥附因
: 子之类的激活它。没经验啊，希望大家给点意见，小弟还指望这个毕业呢。多谢多谢
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 De rein.
猴年马月后 有了的时侯 还记得的话 补个就成。
【在 x***o 的大作中提到】
: 嗯，看看，我好像没baozi，俺是新手，对不住了
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x***o
发帖数: 47 | 11 嗯，一定补。谢谢兄台
【在 l**********1 的大作中提到】
: De rein.
: 猴年马月后 有了的时侯 还记得的话 补个就成。
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x***o
发帖数: 47 | 12 这个就很难泡，而且到现在也没有文章报道过和底物的复合物，单体倒是很多
SPR
【在 d******1 的大作中提到】
: 有了结构，复合体不是小case一个么？把晶体浸在底物里面，多来几次，总会看到一片
: 云的。结合放热并不是每次都能看见的，有些构象变化天生没有热量变化。用NMR，SPR
: 看看吧。
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x***o
发帖数: 47 | 13 有，但也没有结合
【在 b******n 的大作中提到】
: 有没有这三个残基的点突变结果
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 you missed my gender.
not 兄台 but Da-Jie or Xiao-mei.
【在 x***o 的大作中提到】
: 嗯，一定补。谢谢兄台
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C*******e
发帖数: 4348 | 15 刚巧我今天也做的itc
然后也是什么都没看到
请问一下“有些构象变化天生没有热量变化”这个说法有没有什么paper可以做ref?
谢谢
SPR
【在 d******1 的大作中提到】
: 有了结构，复合体不是小case一个么？把晶体浸在底物里面，多来几次，总会看到一片
: 云的。结合放热并不是每次都能看见的，有些构象变化天生没有热量变化。用NMR，SPR
: 看看吧。
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y****d
发帖数: 46 | 16 楼上给的建议都太复杂，有些还需要很好的技术水平才能得到好结果（如SPR），我来帮楼主分析一下。
目前的问题就是通过序列比对发现有可能的催化残基不在活性中心附近，确定不了原因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
首先，保守的残基未必就是催化残基，也许是对稳定过渡态有作用，也许是对底物进行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
其次，如果是想确认有底物存在时蛋白是否有变构，可考虑用经典的光谱方法，如CD，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。 |
x***o
发帖数: 47 | 17 我的结构没有突变，而且itc结果又突变的也有native的，都没有显示结合，我怀疑做
cd之类的也不会有明显变化，谢谢，呵呵，不管怎样，下一步尝试尝试
来帮楼主分析一下。
因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保
守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。
【在 y****d 的大作中提到】
: 楼上给的建议都太复杂，有些还需要很好的技术水平才能得到好结果（如SPR），我来帮楼主分析一下。
: 目前的问题就是通过序列比对发现有可能的催化残基不在活性中心附近，确定不了原因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
: 首先，保守的残基未必就是催化残基，也许是对稳定过渡态有作用，也许是对底物进行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
: 其次，如果是想确认有底物存在时蛋白是否有变构，可考虑用经典的光谱方法，如CD，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。
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g*********r
发帖数: 9366 | 18 你说的对
绝不能仅仅从sequence alignment上找active site , 有的保守点是提供其他功能，比
如substrate binding , co factor binding, 或者结构支撑所必须，甚至是演化中的
冗余
判断catalytical center，如果没有类似的已知information, 必须有mutant /
activity assay 佐证
来帮楼主分析一下。
因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保
守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。
【在 y****d 的大作中提到】
: 楼上给的建议都太复杂，有些还需要很好的技术水平才能得到好结果（如SPR），我来帮楼主分析一下。
: 目前的问题就是通过序列比对发现有可能的催化残基不在活性中心附近，确定不了原因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
: 首先，保守的残基未必就是催化残基，也许是对稳定过渡态有作用，也许是对底物进行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
: 其次，如果是想确认有底物存在时蛋白是否有变构，可考虑用经典的光谱方法，如CD，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。
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d******1
发帖数: 709 | 19 ref.不记得了，你可以去找找，躲在一些物理化学的小杂志里面。
ITC，什么都没看到，有太多的可能性了。
以下有几种可能性。
1：200ul的ITC一般什么都看不到，用4ml的老ITC。
2.换成磷酸溶液。
3. 升高蛋白和底物的溶度。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 刚巧我今天也做的itc
: 然后也是什么都没看到
: 请问一下“有些构象变化天生没有热量变化”这个说法有没有什么paper可以做ref?
: 谢谢
:
: SPR
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d******1
发帖数: 709 | 20 CD和荧光粉不用报什么希望了，太低resolusion了，不过随便做一下也可以，反正用的
量少。
如果蛋白小的话，可以做NMR看一下，一个HSQC就什么都看到了。
最后的一种可能是结晶水，你查一下在预定的第三个碱基位置上是不是有一个保守的水
分子，这个可以通过比较多个结构得到。
【在 x***o 的大作中提到】
: 我的结构没有突变，而且itc结果又突变的也有native的，都没有显示结合，我怀疑做
: cd之类的也不会有明显变化，谢谢，呵呵，不管怎样，下一步尝试尝试
:
: 来帮楼主分析一下。
: 因。怀疑结合底物时有变构现象，但无法确定。
: 行活性中心有关键作用。这些因素都可能导致突变后蛋白失活。总之，这点上只通过保
: 守来判断有些草率，不知道是否还有其他证据。
: ，荧光等。仪器简单，而且对样品无损害，建议楼主尝试。
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x***o
发帖数: 47 | 21 是有一个水分子，呵呵，但是水分子旁边有个ser，通过和同源结构align发现ser的位
置才是催化三联体的第三个残基的位置。但是X在我这个蛋白家族里面（已报道的）序
列上才是保守的，而且这些文章也都没有提到ser可以替代X。所以我还是认为三联体的
第三个残基应该就是X。下一步打算做NMR。谢谢。
【在 d******1 的大作中提到】
: CD和荧光粉不用报什么希望了，太低resolusion了，不过随便做一下也可以，反正用的
: 量少。
: 如果蛋白小的话，可以做NMR看一下，一个HSQC就什么都看到了。
: 最后的一种可能是结晶水，你查一下在预定的第三个碱基位置上是不是有一个保守的水
: 分子，这个可以通过比较多个结构得到。
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 谢谢回复
我用的是1ml的ITC
只有第一个full volume injection看到比background高一点的峰
一个是蛋白浓度低
还有一个可能一下就饱和了（ligand:protein=24:1)
现在准备用更高的蛋白浓度看看
如果第一个峰更高了
可能会再做一次
【在 d******1 的大作中提到】
: ref.不记得了，你可以去找找，躲在一些物理化学的小杂志里面。
: ITC，什么都没看到，有太多的可能性了。
: 以下有几种可能性。
: 1：200ul的ITC一般什么都看不到，用4ml的老ITC。
: 2.换成磷酸溶液。
: 3. 升高蛋白和底物的溶度。
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d******1
发帖数: 709 | 23 这就很简单了。 蛋白质溶度太低，ITC看得不大清楚，至少要提高5-10倍的浓度吧。因
为fitting的时候至少要5-10个点。
呵呵，要不然就找那种最老的要4ml的ITC吧。
ITC很烦的，我的一个图，折腾了有半年，如果表达量高还好，不高，累死。。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢回复
: 我用的是1ml的ITC
: 只有第一个full volume injection看到比background高一点的峰
: 一个是蛋白浓度低
: 还有一个可能一下就饱和了（ligand:protein=24:1)
: 现在准备用更高的蛋白浓度看看
: 如果第一个峰更高了
: 可能会再做一次
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 恩，这个烧蛋白的速度比做结晶还快啊
我那天起始用的40 mg蛋白
很不幸透析的时候crush out了大半
结果最后做的时候浓度就不够了。。。。。
而且有点tricky
就算看到了binding
为了好的fitting应该还要找到比较合适的ligand:protein比才能保证每个阶段都有点啊
请问一般来说ligand:protein多少合适：
10：1会不会太快饱和？
5：1开始试可以么
【在 d******1 的大作中提到】
: 这就很简单了。 蛋白质溶度太低，ITC看得不大清楚，至少要提高5-10倍的浓度吧。因
: 为fitting的时候至少要5-10个点。
: 呵呵，要不然就找那种最老的要4ml的ITC吧。
: ITC很烦的，我的一个图，折腾了有半年，如果表达量高还好，不高，累死。。。。
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