s*********a
发帖数: 1409 | 1 老板要交grant，天天逼data，我快被逼疯了。
实验室学生切的片子，是PBS perfuse的小鼠脑子，然后在4%PFA 4度过夜fix，然后放
到pbs里，室温切片，40UM厚。我第一次觉得片子太厚了，用了漂片法，荧光染色，染
完了再mount到slides上，效果还马马虎虎。可是老板不喜欢荧光，喜欢DAB染色。说是
同时有人的脑染色，人脑用的是DAB，鼠脑也要用DAB才行。我也不知道是什么理论。我
只好又做DAB染色。可是我没做过DAB，完全照实验室的protocol做了两次，没做出来。
用的是贴片法，我想是不是片子太厚了，所以染不出来。可我老板偏认定是抗体浓度的
问题，让我继续试抗体浓度。我觉得真不是浓度问题，因为啥也没出来。
这个实验室染色用的protocol和我以前lab的很不一样。我们以前都是pbs+PfA灌流，然
后fix过夜，蔗糖沉降，oct包埋冷冻切片，从来没超过10um厚，然后荧光染色。这个
lab染色就没怎么做出来过，可是老板偏要按照他那套来。我觉得他就是火星来的。 |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 嗯,你和我老板刚好相反
她什么都爱用荧光,特别不喜欢DAB.....
40uM肯定可以用的
我们实验室常用的就是40uM,也是PBS 灌流然后4% PFA fix 过夜,
不过是用的冷冻切片
当然10um的切片做出来的IHC/IF要更sharp一点
你先看看二抗是不是用对了 |
n***w
发帖数: 2405 | |
M******s
发帖数: 138 | 4 你这个是振动机切的吧？DAB也可以用在漂片上，40也不算厚，不过和抗原种类，抗体
都有关系，如果你荧光用漂片做出来了，那么DAB也应该能用漂片做出来，可不可以说
一下你的详细步骤，也许能帮你看看
【在 s*********a 的大作中提到】
: 老板要交grant，天天逼data，我快被逼疯了。
: 实验室学生切的片子，是PBS perfuse的小鼠脑子，然后在4%PFA 4度过夜fix，然后放
: 到pbs里，室温切片，40UM厚。我第一次觉得片子太厚了，用了漂片法，荧光染色，染
: 完了再mount到slides上，效果还马马虎虎。可是老板不喜欢荧光，喜欢DAB染色。说是
: 同时有人的脑染色，人脑用的是DAB，鼠脑也要用DAB才行。我也不知道是什么理论。我
: 只好又做DAB染色。可是我没做过DAB，完全照实验室的protocol做了两次，没做出来。
: 用的是贴片法，我想是不是片子太厚了，所以染不出来。可我老板偏认定是抗体浓度的
: 问题，让我继续试抗体浓度。我觉得真不是浓度问题，因为啥也没出来。
: 这个实验室染色用的protocol和我以前lab的很不一样。我们以前都是pbs+PfA灌流，然
: 后fix过夜，蔗糖沉降，oct包埋冷冻切片，从来没超过10um厚，然后荧光染色。这个
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s*********a
发帖数: 1409 | 5 老板要交grant，天天逼data，我快被逼疯了。
实验室学生切的片子，是PBS perfuse的小鼠脑子，然后在4%PFA 4度过夜fix，然后放
到pbs里，室温切片，40UM厚。我第一次觉得片子太厚了，用了漂片法，荧光染色，染
完了再mount到slides上，效果还马马虎虎。可是老板不喜欢荧光，喜欢DAB染色。说是
同时有人的脑染色，人脑用的是DAB，鼠脑也要用DAB才行。我也不知道是什么理论。我
只好又做DAB染色。可是我没做过DAB，完全照实验室的protocol做了两次，没做出来。
用的是贴片法，我想是不是片子太厚了，所以染不出来。可我老板偏认定是抗体浓度的
问题，让我继续试抗体浓度。我觉得真不是浓度问题，因为啥也没出来。
这个实验室染色用的protocol和我以前lab的很不一样。我们以前都是pbs+PfA灌流，然
后fix过夜，蔗糖沉降，oct包埋冷冻切片，从来没超过10um厚，然后荧光染色。这个
lab染色就没怎么做出来过，可是老板偏要按照他那套来。我觉得他就是火星来的。 |
h*******o
发帖数: 4884 | 6 嗯,你和我老板刚好相反
她什么都爱用荧光,特别不喜欢DAB.....
40uM肯定可以用的
我们实验室常用的就是40uM,也是PBS 灌流然后4% PFA fix 过夜,
不过是用的冷冻切片
当然10um的切片做出来的IHC/IF要更sharp一点
你先看看二抗是不是用对了 |
n***w
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M******s
发帖数: 138 | 8 你这个是振动机切的吧？DAB也可以用在漂片上，40也不算厚，不过和抗原种类，抗体
都有关系，如果你荧光用漂片做出来了，那么DAB也应该能用漂片做出来，可不可以说
一下你的详细步骤，也许能帮你看看
【在 s*********a 的大作中提到】
: 老板要交grant，天天逼data，我快被逼疯了。
: 实验室学生切的片子，是PBS perfuse的小鼠脑子，然后在4%PFA 4度过夜fix，然后放
: 到pbs里，室温切片，40UM厚。我第一次觉得片子太厚了，用了漂片法，荧光染色，染
: 完了再mount到slides上，效果还马马虎虎。可是老板不喜欢荧光，喜欢DAB染色。说是
: 同时有人的脑染色，人脑用的是DAB，鼠脑也要用DAB才行。我也不知道是什么理论。我
: 只好又做DAB染色。可是我没做过DAB，完全照实验室的protocol做了两次，没做出来。
: 用的是贴片法，我想是不是片子太厚了，所以染不出来。可我老板偏认定是抗体浓度的
: 问题，让我继续试抗体浓度。我觉得真不是浓度问题，因为啥也没出来。
: 这个实验室染色用的protocol和我以前lab的很不一样。我们以前都是pbs+PfA灌流，然
: 后fix过夜，蔗糖沉降，oct包埋冷冻切片，从来没超过10um厚，然后荧光染色。这个
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 RE LZ
if still no fixed it
you can refer below 2011 one paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20361056
they used "FD NeuroSilver kit" for 40 μm-thick coronal sections
that kit link:
//www.mtrscientific.com/FDneurosilverHome.html |
D*a
发帖数: 6830 | 10 小鼠40太厚了吧？好几层细胞都重叠在一起了啊。我们实验室一女生切30就去照
confocal了，否则看不出来到底哪个细胞染上了啊。 |
q******g
发帖数: 3858 | 11 荧光染色都出来了，肯定不是抗体的事。我以前曾经遇到DAB过期，死活不出结果。后
来我换了新的DAB， 新的二抗，就出结果了。 |
