g*********5
发帖数: 2533 | 1 用过Openbiosystemde pLKO shRNA，效果很好
想用lentivirus表达稳定珠。
买了invitrogen的pLentidestz载体，构建质粒，转染293，收上清，感染细胞，过两天
加抗生素，细胞活，但是目的蛋白不表达。
addgene又买了些pLentidest，装载体，。。。。细胞活，不表达
addgene买了pLX,装载体.......................细胞活，不表达
折腾两年了...
到底问题出在哪里？
请作lenti表达的牛牛们帮我分析分析。谢谢。 |
A******y
发帖数: 2041 | 2 What kind of cell is your target? Some cell won't take lentivirus at all...
...I ran into one. Did you check your 293 cell to see if you protein is
over-expressed? |
g*********5
发帖数: 2533 | 3 这些细胞应该能用的，mel，lentivirus shRNA没有问题。
没有试293。你的意思是感染后的293还可以wb检测？
还是用上清去感染293？谢谢。 |
Z******5
发帖数: 435 | 4 我准备用pll3.7表达呢，正在构建载体，你这个帖子看得我心惶惶啊~~~~ |
a*****x
发帖数: 901 | 5 titer有没有测？cDNA直接转是否表达？感染后的293可以直接看的。可以用加IRES-GFP
的lenti construct, 直接看荧光就知道有没有转。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 6 没有测titer....
cDNA直接转wb验证过。
谢谢。没有IRES-GFPconstruct。
GFP
【在 a*****x 的大作中提到】
: titer有没有测？cDNA直接转是否表达？感染后的293可以直接看的。可以用加IRES-GFP
: 的lenti construct, 直接看荧光就知道有没有转。
|
a*****x
发帖数: 901 | 7 wb验证只能保证cDNA区域，不能保证packaging区域。测一下titer吧，不难的。或者至
少全质粒测一下序，看packaging sequence有没有问题。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 8 thanks
【在 a*****x 的大作中提到】
: wb验证只能保证cDNA区域，不能保证packaging区域。测一下titer吧，不难的。或者至
: 少全质粒测一下序，看packaging sequence有没有问题。
|
B****n
发帖数: 22 | 9 the cell survived your selection. so your lentivirus works fine.
you may extract the DNA from the infected cell to see if your cDNA is still
there or not.
If i remember correctly, when you transfected 293T cells, the region between
the 2 LTR region will be transcribed and spliced. when the lentivirus
infects cells, the virus genome(RNA) will be retrotranscribed into DNA and
integrated into genome. So if there is any intron or intron like structure
in your contruct, it maybe processed as an intron and excised out. |
g*********5
发帖数: 2533 | 10 thank you, it's a good point, I would try it. extract DNA and PCR my target
gene.
the question is I tried several cDNA, And all they have intron like
structure?
still
between
【在 B****n 的大作中提到】
: the cell survived your selection. so your lentivirus works fine.
: you may extract the DNA from the infected cell to see if your cDNA is still
: there or not.
: If i remember correctly, when you transfected 293T cells, the region between
: the 2 LTR region will be transcribed and spliced. when the lentivirus
: infects cells, the virus genome(RNA) will be retrotranscribed into DNA and
: integrated into genome. So if there is any intron or intron like structure
: in your contruct, it maybe processed as an intron and excised out.
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d*p
发帖数: 534 | 11 Which promoter did you use? Most of times, it is because your promoter doesn
't work well. |
C*****h
发帖数: 926 | 12 用lentivirus去overexpress蛋白，是很难的。
单个细胞最多接受几个virus，基本上不会有多少蛋白表达（很难检测到）。
在mammalian cells里，蛋白表达本来就不是高效的。
用质粒直接转染，每个细胞接受几万个copies，蛋白质表达都不是很高，
区区一两个virus能在细胞里表达多少蛋白质？
【在 g*********5 的大作中提到】
: 用过Openbiosystemde pLKO shRNA，效果很好
: 想用lentivirus表达稳定珠。
: 买了invitrogen的pLentidestz载体，构建质粒，转染293，收上清，感染细胞，过两天
: 加抗生素，细胞活，但是目的蛋白不表达。
: addgene又买了些pLentidest，装载体，。。。。细胞活，不表达
: addgene买了pLX,装载体.......................细胞活，不表达
: 折腾两年了...
: 到底问题出在哪里？
: 请作lenti表达的牛牛们帮我分析分析。谢谢。
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a*****x
发帖数: 901 | 13 good point. missed the info that the selection worked.
still
between
【在 B****n 的大作中提到】
: the cell survived your selection. so your lentivirus works fine.
: you may extract the DNA from the infected cell to see if your cDNA is still
: there or not.
: If i remember correctly, when you transfected 293T cells, the region between
: the 2 LTR region will be transcribed and spliced. when the lentivirus
: infects cells, the virus genome(RNA) will be retrotranscribed into DNA and
: integrated into genome. So if there is any intron or intron like structure
: in your contruct, it maybe processed as an intron and excised out.
|
a*****x
发帖数: 901 | 14 Depending on the promoter and cell type. Some works really well -- many
transgenic cell lines or animals have only one or two copies of the
transgene and yet express fine -- imaging it's the same case for those
abundantly expressed endogenous protein as well.
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lentivirus去overexpress蛋白，是很难的。
: 单个细胞最多接受几个virus，基本上不会有多少蛋白表达（很难检测到）。
: 在mammalian cells里，蛋白表达本来就不是高效的。
: 用质粒直接转染，每个细胞接受几万个copies，蛋白质表达都不是很高，
: 区区一两个virus能在细胞里表达多少蛋白质？
|
j******i
发帖数: 939 | 15 我觉得你可以做以下尝试
1. 直接用transfer vector(含你目的基因的那个plasmid, 不用vsvg，REV, gagpol)
transfect你的cell 可以看到蛋白条带吗？如果没有，说明你的目的基因可能出错了，
是不是in frame啊，有没有kozac sequence啊。。。如果有蛋白条带，那么
2. 测p24, 看看到底没有virus啊。如果有virus，那么
3. Infection效率如何啊，有没有足够多的virus啊。 |
w********e
发帖数: 2113 | 16 检测目标蛋白都用了那些，单一的western是不够的，最好用识别不同抗原端的抗体佐
证一下，有可能过度表达时已经被cleavage了 |
g*********5
发帖数: 2533 | 17 谢谢。以前用pcdna座的稳定转染也应该是单拷贝的，但是表达还可以阿。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lentivirus去overexpress蛋白，是很难的。
: 单个细胞最多接受几个virus，基本上不会有多少蛋白表达（很难检测到）。
: 在mammalian cells里，蛋白表达本来就不是高效的。
: 用质粒直接转染，每个细胞接受几万个copies，蛋白质表达都不是很高，
: 区区一两个virus能在细胞里表达多少蛋白质？
|
g*********5
发帖数: 2533 | 18 CMV。
doesn
【在 d*p 的大作中提到】
: Which promoter did you use? Most of times, it is because your promoter doesn
: 't work well.
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 谢谢牛牛。
1。我设计引物直接把ORF从pcdna质粒上扩增出来，然后装入pENTR，再到destination
病毒载体。
pcdna质粒表达没有问题，wb检测多次；pENTR也测了序。kozak序列倒是没有，因为
pcmv是强启动子。我将试试单转lentiv vector.看看表达与否。
2。p24是病毒的蛋白吗？
3。infection效率不知道。我要老老实实地作一次。
【在 j******i 的大作中提到】
: 我觉得你可以做以下尝试
: 1. 直接用transfer vector(含你目的基因的那个plasmid, 不用vsvg，REV, gagpol)
: transfect你的cell 可以看到蛋白条带吗？如果没有，说明你的目的基因可能出错了，
: 是不是in frame啊，有没有kozac sequence啊。。。如果有蛋白条带，那么
: 2. 测p24, 看看到底没有virus啊。如果有virus，那么
: 3. Infection效率如何啊，有没有足够多的virus啊。
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g*********5
发帖数: 2533 | 20 谢谢。我总共试了4个基因。不会都被cleavage吧？
我怀疑我的载体在构建过程中LTR发生了重组。
【在 w********e 的大作中提到】
: 检测目标蛋白都用了那些，单一的western是不够的，最好用识别不同抗原端的抗体佐
: 证一下，有可能过度表达时已经被cleavage了
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s******r
发帖数: 1245 | 21 装个GFP之类的先看看，看不见荧光就是系统不行，有荧光的话起码virus没问题，再看
其他 |
g*********5
发帖数: 2533 | 22 thank, that is what am I doing NOW :)
【在 s******r 的大作中提到】
: 装个GFP之类的先看看，看不见荧光就是系统不行，有荧光的话起码virus没问题，再看
: 其他
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h******t
发帖数: 56 | 23 我和你有一样的问题。也是用的pEN entry vector 然后做LR reaction 到目的lentivirus vector 里面。我的三个蛋白都有GFP，所以我能测到virus的表达。但是titer非常低，大概只有5%这个样子，而我的GFP control可以有40%。我的这个project暂时已经不做了，就是因为无法表达我的蛋白。现在看到你的帖子，觉得很有可能我们是同样的问题。可以考虑用一个不需要LR reaction的vector来试试
【在 g*********5 的大作中提到】
: 用过Openbiosystemde pLKO shRNA，效果很好
: 想用lentivirus表达稳定珠。
: 买了invitrogen的pLentidestz载体，构建质粒，转染293，收上清，感染细胞，过两天
: 加抗生素，细胞活，但是目的蛋白不表达。
: addgene又买了些pLentidest，装载体，。。。。细胞活，不表达
: addgene买了pLX,装载体.......................细胞活，不表达
: 折腾两年了...
: 到底问题出在哪里？
: 请作lenti表达的牛牛们帮我分析分析。谢谢。
|
h******t
发帖数: 56 | 24 我当时sequence了我的vector里面基本上全部有用的序列，都是对的。同时我也试了用
另外一个可以直接clone的lenti vector （不需要pEN),效果就很好。
但是我也想不明白为什么LR reaction 会导致virus titer降低，不知道有没有牛人能
解释这个现象。 |
w******n
发帖数: 767 | 25 是核蛋白么？
手里有一个project也是这样的，wb一抗提高到1：50检到两个蛋白，还有一个没搞定，
郁闷中。。。
【在 g*********5 的大作中提到】
: 用过Openbiosystemde pLKO shRNA，效果很好
: 想用lentivirus表达稳定珠。
: 买了invitrogen的pLentidestz载体，构建质粒，转染293，收上清，感染细胞，过两天
: 加抗生素，细胞活，但是目的蛋白不表达。
: addgene又买了些pLentidest，装载体，。。。。细胞活，不表达
: addgene买了pLX,装载体.......................细胞活，不表达
: 折腾两年了...
: 到底问题出在哪里？
: 请作lenti表达的牛牛们帮我分析分析。谢谢。
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g*********5
发帖数: 2533 | |
g*********5
发帖数: 2533 | 27 您那个直接克隆的载体叫做什么？
谢谢。
【在 h******t 的大作中提到】
: 我当时sequence了我的vector里面基本上全部有用的序列，都是对的。同时我也试了用
: 另外一个可以直接clone的lenti vector （不需要pEN),效果就很好。
: 但是我也想不明白为什么LR reaction 会导致virus titer降低，不知道有没有牛人能
: 解释这个现象。
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w******n
发帖数: 767 | 28 谨慎认为蛋白已经表达，试一下别的方法，IF.或者富集细胞器WB.
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢不是核蛋白，应该是线粒体的蛋白。
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h******t
发帖数: 56 | 29 我先用的是pEN-TmiRC3 entry vector和pslik-Neo 目的质粒，效率非常低。
后来试用了pWPI vector, 在addgene就有，效率就非常高了，但是pWPI vector是第二
代 lentivirus vector,我就没有继续使用了。所以我也不能完全确定的说是因为LR
reaction造成了问题还是因为第二代lentivirus因为有更多的HIV gene,所以效率更高
。希望你的试验能给个更conclusive的答案。
【在 g*********5 的大作中提到】
: 您那个直接克隆的载体叫做什么？
: 谢谢。
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g*********5
发帖数: 2533 | 30 我后来用的是pLX,也是二代，但是是gateway destination vector.
蛋白表达太低？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 31 如果表达比内源的还低，就没有意思了...
【在 w******n 的大作中提到】
: 谨慎认为蛋白已经表达，试一下别的方法，IF.或者富集细胞器WB.
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h******t
发帖数: 56 | 32 那根据你现在说的和我自己的实验结果、，我更倾向于LR reaction somehow cause
problems. 强烈建议试试非gateway 的载体
【在 g*********5 的大作中提到】
: 我后来用的是pLX,也是二代，但是是gateway destination vector.
: 蛋白表达太低？
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h******t
发帖数: 56 | 33 那根据你现在说的和我自己的实验结果、，我更倾向于LR reaction somehow cause
problems. 强烈建议试试非gateway 的载体
【在 g*********5 的大作中提到】
: 我后来用的是pLX,也是二代，但是是gateway destination vector.
: 蛋白表达太低？
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g*********5
发帖数: 2533 | 34 谢谢。我的好像都是gateway。。。
还有什么不带GFP的lentivirus vector吗？
cause
【在 h******t 的大作中提到】
: 那根据你现在说的和我自己的实验结果、，我更倾向于LR reaction somehow cause
: problems. 强烈建议试试非gateway 的载体
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a*****x
发帖数: 901 | 35 用过pUBC6-lenti，invitrogen的，也是gateway，效果很好 |
h******t
发帖数: 56 | 36 我觉得不是每次gateway都不work,但是gateway可能对某种sequence特别敏感，导致出
现问题。
我用过的就这些了，但是我搜了一下，addgene上还是有很多没有GFP，不是gateway的
lentivirus vector的，不知道pLKO.1怎么样
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢。我的好像都是gateway。。。
: 还有什么不带GFP的lentivirus vector吗？
:
: cause
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g*********5
发帖数: 2533 | 37 这个是shRNA的吧。shRNA用的效果很好
【在 h******t 的大作中提到】
: 我觉得不是每次gateway都不work,但是gateway可能对某种sequence特别敏感，导致出
: 现问题。
: 我用过的就这些了，但是我搜了一下，addgene上还是有很多没有GFP，不是gateway的
: lentivirus vector的，不知道pLKO.1怎么样
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g*********5
发帖数: 2533 | 38 pLenti6⁄UbC⁄V5-DEST™ vector ？
【在 a*****x 的大作中提到】
: 用过pUBC6-lenti，invitrogen的，也是gateway，效果很好
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h******t
发帖数: 56 | 39 我不知道这么说到底对𣎴对，但是我感觉好像很多用于siRNA的质粒也可以用来
做普通的lentivirus vector.我老板postdoc的时候就成功的用pslik转几个不同的非
siRNA基因,
【在 g*********5 的大作中提到】
: 这个是shRNA的吧。shRNA用的效果很好
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 这个要把cDNA的启动子装进去吧.
【在 h******t 的大作中提到】
: 我不知道这么说到底对𣎴对，但是我感觉好像很多用于siRNA的质粒也可以用来
: 做普通的lentivirus vector.我老板postdoc的时候就成功的用pslik转几个不同的非
: siRNA基因,
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g*********5
发帖数: 2533 | 41 去年有篇cell文章作者改装plko.1表达cDNA.
他去掉u6启动子，然后装上CMV启动子和基因表达。
问题是加尾信号咋办
有人说不能有加尾信号，会中止病毒RNA的...
搞糊涂了...
【在 h******t 的大作中提到】
: 我觉得不是每次gateway都不work,但是gateway可能对某种sequence特别敏感，导致出
: 现问题。
: 我用过的就这些了，但是我搜了一下，addgene上还是有很多没有GFP，不是gateway的
: lentivirus vector的，不知道pLKO.1怎么样
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h******t
发帖数: 56 | 42 我们用的pslik本身就是CMV启动字。Vector都是自己有polyA序列的吧。我也看到那个
帖子了，可能那个作者的建议是不需要自己再加polyA序列。 |
