g******a
发帖数: 63 | 1 最近在做Chromatin IP, 以前都做转录因子结合DNA，一般先做个预测，然后蛋白拉
下来做pcr。老板说想看下转录因子结合后，组蛋白在该基因启动子区域结合的变化。
我想请教一下组蛋白结合在DNA启动子上的什么区域，好方便设计引物？是ATG
start codon附近还是TATA box之类的呢？
另外，如果我选一个促进的，一个抑制的组蛋白，可以选H3K9Ac和H3K9Me2/
H3K27Me2的antibody吗？
以前没有做过组蛋白的问题，请熟手不吝赐教，感激不尽。 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 我瞎说两句，可能没理解你的问题。
你是打算做seq还是pcr? seq的话所有基因都看到，pcr的话你怎么做
定量？realtime? 另外，组蛋白是everywhere，除了start site低一点，
你怎么设计引物？还是你打算看特定位置的组蛋白，比如-1?
【在 g******a 的大作中提到】
: 最近在做Chromatin IP, 以前都做转录因子结合DNA，一般先做个预测，然后蛋白拉
: 下来做pcr。老板说想看下转录因子结合后，组蛋白在该基因启动子区域结合的变化。
: 我想请教一下组蛋白结合在DNA启动子上的什么区域，好方便设计引物？是ATG
: start codon附近还是TATA box之类的呢？
: 另外，如果我选一个促进的，一个抑制的组蛋白，可以选H3K9Ac和H3K9Me2/
: H3K27Me2的antibody吗？
: 以前没有做过组蛋白的问题，请熟手不吝赐教，感激不尽。
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g******a
发帖数: 63 | 3 谢谢ls回帖，我就是做传统的chromatin ip，最后用realtime或者用普通pcr跑胶看条
带。原来组蛋白everywhere？那一般怎么看DNA上的组蛋白数量，种类和状态？用组蛋
白抗体拉下dna后，用引物扩什么特别的序列，可以得到阳性结果？我对组蛋白实在是
不了解，见笑了！
【在 s******s 的大作中提到】
: 我瞎说两句，可能没理解你的问题。
: 你是打算做seq还是pcr? seq的话所有基因都看到，pcr的话你怎么做
: 定量？realtime? 另外，组蛋白是everywhere，除了start site低一点，
: 你怎么设计引物？还是你打算看特定位置的组蛋白，比如-1?
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O*C
发帖数: 649 | 4 你要看组蛋白上面什么样的变化？methylation, Ub, Ac?还是和dna bind的dynamic？
每个nucleosome里面组蛋白是个octamer，h2a, h2b, h3, h4 X2，外面饶130左右个bp
，你要看那个？
【在 g******a 的大作中提到】
: 谢谢ls回帖，我就是做传统的chromatin ip，最后用realtime或者用普通pcr跑胶看条
: 带。原来组蛋白everywhere？那一般怎么看DNA上的组蛋白数量，种类和状态？用组蛋
: 白抗体拉下dna后，用引物扩什么特别的序列，可以得到阳性结果？我对组蛋白实在是
: 不了解，见笑了！
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g******a
发帖数: 63 | 5 我想以H3K9Me2和H3K9Ac两个组蛋白为例，看他们在DNA上的结合多少，来表明该基因是
被抑制还是被激活。
bp
【在 O*C 的大作中提到】
: 你要看组蛋白上面什么样的变化？methylation, Ub, Ac?还是和dna bind的dynamic？
: 每个nucleosome里面组蛋白是个octamer，h2a, h2b, h3, h4 X2，外面饶130左右个bp
: ，你要看那个？
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g******a
发帖数: 63 | 6 我也不知道是不是我问题问得不好，还是我了解太少，为什么回贴的各位大哥都很
confuse似的，把基础知识说一遍，反过来问我一堆问题，如果组蛋白结合的情况各异
，很难一两句讲明白，不如能发我个有代表性的文章或综述最好了 |
g******a
发帖数: 63 | 7 我只是准备用组蛋白抗体做常规的chromatin ip来看基因启动子区域是活化的还是抑制
的，教我用哪个抗体做哪段dna的pcr就好了嘛 |
O*C
发帖数: 649 | 8 这回知道你要干什么了。不过我不是做分子生物学的，只知道怎么合成各种组蛋白。不
知道你能找到好的抗体不？印象中Me2，Me同一个抗体都识别。还有你怎么确定这个H3
的PTM只有你要的K9 Me2 or Ac？
【在 g******a 的大作中提到】
: 我想以H3K9Me2和H3K9Ac两个组蛋白为例，看他们在DNA上的结合多少，来表明该基因是
: 被抑制还是被激活。
:
: bp
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g******a
发帖数: 63 | 9 Thanks. In fact, i have no idea, otherwise, i won't be so desperate to ask
questions on mitbbs.
H3
【在 O*C 的大作中提到】
: 这回知道你要干什么了。不过我不是做分子生物学的，只知道怎么合成各种组蛋白。不
: 知道你能找到好的抗体不？印象中Me2，Me同一个抗体都识别。还有你怎么确定这个H3
: 的PTM只有你要的K9 Me2 or Ac？
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s*********t
发帖数: 600 | 10 跟转录抑制有关，H3K27me1 K9me3，激活的选K4me3
在TSS前选几段 做Q PCR试试
【在 g******a 的大作中提到】
: Thanks. In fact, i have no idea, otherwise, i won't be so desperate to ask
: questions on mitbbs.
:
: H3
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g******a
发帖数: 63 | 11 thanks。TSS是什么的缩写？
【在 s*********t 的大作中提到】
: 跟转录抑制有关，H3K27me1 K9me3，激活的选K4me3
: 在TSS前选几段 做Q PCR试试
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s*********t
发帖数: 600 | 12 transcription start site
【在 g******a 的大作中提到】
: thanks。TSS是什么的缩写？
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s*********t
发帖数: 600 | 13 H3K9Me2和H3K9Ac不是组蛋白，只是组蛋白H3尾巴上的某个氨基酸的修饰。针对这些修
饰有特异的抗体（当然有的不像自己声称的那么特异）
选K27me3/2 K9me3/2/1 K4me3/2 K9ac看看，再用针对H3的抗体做control，normalize
在TSS前边选几段 做Q PCR
还可以看H2Bub，pol II的磷酸化吧，根据你的实验和对细胞的处理
【在 g******a 的大作中提到】
: 我想以H3K9Me2和H3K9Ac两个组蛋白为例，看他们在DNA上的结合多少，来表明该基因是
: 被抑制还是被激活。
:
: bp
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 You can try by this novel Nucleic acid/s binding Protein/s intrinsic
fluorescence analyzer for your experiment:
References:
//www.auc2012.uthscsa.edu/Duhr/Nature_Communications_Wienken_etal.pdf
//www.auc2012.uthscsa.edu/Duhr/MST_Publications.pdf
plus link:
//www.auc2012.uthscsa.edu/Duhr/Technology_Summary.pdf
NT.LabelFree: Measuring with intrinsic fluorescence:
Since no label is needed, also samples that might be sensitive to a labeling
procedure (e.g. some membrane receptors) can be measured.
The system is very sensitive, even for slightest modification of your
molecule of interest.
The system works perfectly for all systems where the titrated binding
partner shows no or only a weak intrinsic fluorescence. That includes
Nucleic acids, Peptides, Sugars most Small Molecules and many Proteins.
more relative files:
//www.auc2012.uthscsa.edu/Duhr/index.html
all were shown at below 2012 20th International Analytical Ultracentrifugation Conference now:
//auc2012.uthscsa.edu/speakers.php
【在 g******a 的大作中提到】
: Thanks. In fact, i have no idea, otherwise, i won't be so desperate to ask
: questions on mitbbs.
:
: H3
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g******a
发帖数: 63 | |
