l*******e
发帖数: 170 | 1 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
3. 纯化genome DNA
4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对 |
d**p
发帖数: 149 | 2 1500kb? or 1500bp
no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
|
l*******e
发帖数: 170 | 3 我说错了，是1500 bp
我是想买个kit纯化genome DNA, 实验室里的kit都是纯化质粒的
然后PCR这个1500bp的东东
【在 d**p 的大作中提到】
: 1500kb? or 1500bp
: no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.
|
d**p
发帖数: 149 | 4 Basically, this is the way to do it.
But you may meet a lot of detailed questions when you work on it.
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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d****i
发帖数: 2346 | 5 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。 |
l*******e
发帖数: 170 | 6 BAC是什么，为什么genomic DNA那成功呢？
我们做小鼠genotyping不都是用genomic DNA吗。
【在 d****i 的大作中提到】
: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。
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r***e
发帖数: 2539 | 7 1.5kb问题不是很大。
【在 d****i 的大作中提到】
: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。
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l******a
发帖数: 3339 | 8 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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c**********r
发帖数: 2372 | 9 re
【在 l******a 的大作中提到】
: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
|
l******a
发帖数: 3339 | 10 真心不明白楼上各位，什么纯化，什么BAC做模板，什么more detail的，在说些什么。
。。
【在 c**********r 的大作中提到】
: re
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l*******e
发帖数: 170 | 11 你的回答给我很大信心。
【在 l******a 的大作中提到】
: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
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w*******d
发帖数: 396 | 12 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。 |
l******a
发帖数: 3339 | 13 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？
【在 w*******d 的大作中提到】
: 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。
|
r***e
发帖数: 2539 | 14 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
。这是当年经典的做法。
【在 l******a 的大作中提到】
: 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？
|
s******r
发帖数: 91 | 15 运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多
【在 r***e 的大作中提到】
: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。
|
l*********i
发帖数: 22 | 16 不明白为什么不用合成基因，几百块两个星期就行了，买什么各种试剂盒也不少钱啊？
是为了练习积攒经验么？ |
z*******6
发帖数: 679 | 17 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
... |
m*****z
发帖数: 1451 | 18 基本是这样。
难度相当于十年前本科毕设课题。
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
|
a*******a
发帖数: 4233 | 19 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把
【在 r***e 的大作中提到】
: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。
|
h**2
发帖数: 2841 | 20 +1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定
【在 a*******a 的大作中提到】
: 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把
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|
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t*****w
发帖数: 254 | 21 我可以分析ChIPseq data， 但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
了。
【在 h**2 的大作中提到】
: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定
|
d****i
发帖数: 2346 | 22
求JBC papers link。。谢谢！
【在 z*******6 的大作中提到】
: 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
: 你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
: 不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
: ...
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h**2
发帖数: 2841 | 23 哈哈，我收$0，还请他吃顿饭交个朋友，抢你生意了
【在 t*****w 的大作中提到】
: 我可以分析ChIPseq data， 但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
: 了。
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l*******e
发帖数: 170 | 24 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
3. 纯化genome DNA
4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对 |
d**p
发帖数: 149 | 25 1500kb? or 1500bp
no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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l*******e
发帖数: 170 | 26 我说错了，是1500 bp
我是想买个kit纯化genome DNA, 实验室里的kit都是纯化质粒的
然后PCR这个1500bp的东东
【在 d**p 的大作中提到】
: 1500kb? or 1500bp
: no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.
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d**p
发帖数: 149 | 27 Basically, this is the way to do it.
But you may meet a lot of detailed questions when you work on it.
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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d****i
发帖数: 2346 | 28 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。 |
l*******e
发帖数: 170 | 29 BAC是什么，为什么genomic DNA那成功呢？
我们做小鼠genotyping不都是用genomic DNA吗。
【在 d****i 的大作中提到】
: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。
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r***e
发帖数: 2539 | 30 1.5kb问题不是很大。
【在 d****i 的大作中提到】
: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。
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l******a
发帖数: 3339 | 31 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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c**********r
发帖数: 2372 | 32 re
【在 l******a 的大作中提到】
: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
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l******a
发帖数: 3339 | 33 真心不明白楼上各位，什么纯化，什么BAC做模板，什么more detail的，在说些什么。
。。
【在 c**********r 的大作中提到】
: re
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l*******e
发帖数: 170 | 34 你的回答给我很大信心。
【在 l******a 的大作中提到】
: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。
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w*******d
发帖数: 396 | 35 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。 |
l******a
发帖数: 3339 | 36 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？
【在 w*******d 的大作中提到】
: 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。
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r***e
发帖数: 2539 | 37 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
。这是当年经典的做法。
【在 l******a 的大作中提到】
: 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？
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s******r
发帖数: 91 | 38 运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多
【在 r***e 的大作中提到】
: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。
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l*********i
发帖数: 22 | 39 不明白为什么不用合成基因，几百块两个星期就行了，买什么各种试剂盒也不少钱啊？
是为了练习积攒经验么？ |
z*******6
发帖数: 679 | 40 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
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m*****z
发帖数: 1451 | 41 基本是这样。
难度相当于十年前本科毕设课题。
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
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a*******a
发帖数: 4233 | 42 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把
【在 r***e 的大作中提到】
: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。
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h**2
发帖数: 2841 | 43 +1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定
【在 a*******a 的大作中提到】
: 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把
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t*****w
发帖数: 254 | 44 我可以分析ChIPseq data， 但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
了。
【在 h**2 的大作中提到】
: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定
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d****i
发帖数: 2346 | 45
求JBC papers link。。谢谢！
【在 z*******6 的大作中提到】
: 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
: 你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
: 不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
: ...
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h**2
发帖数: 2841 | 46 哈哈，我收$0，还请他吃顿饭交个朋友，抢你生意了
【在 t*****w 的大作中提到】
: 我可以分析ChIPseq data， 但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
: 了。
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l**********e
发帖数: 146 | 47 1.5kb，怎么pcr，怎么成，没啥担心的。即使GC高，换个LA taq也就成了。 |
h*********1
发帖数: 897 | 48 data base能查到的东西你让LZ瞎折腾个什么？
【在 r***e 的大作中提到】
: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。
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h*********1
发帖数: 897 | 49 没必要那么多，十几个到几十个bp足矣。
【在 h**2 的大作中提到】
: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定
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x********e
发帖数: 35261 | 50 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
有TSS，引物设计在TSS之前。
4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用
于in vitro assay。GFP， lacZ，luciferase等reporter vector中选个适合自己的。
确定你要用的酶切位点。克隆genomic DNA有时候酶切位点有限制，设计引物的时候要
参考reporter vector的MCS和目标序列。
暂时就想到这些。
【在 l*******e 的大作中提到】
: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对
|
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x********e
发帖数: 35261 | 51 哈哈 深有体会
【在 s******r 的大作中提到】
: 运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多
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x********e
发帖数: 35261 | 52 再补充一个。克隆genomic sequence时如果找不到合适的酶切位点（克隆序列越长，酶
切位点越受限）可以考虑gibson assembly。
Seq
exon
【在 x********e 的大作中提到】
: 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
: 等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
: 2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
: 土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
: template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
: library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
: 后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
: 3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
: 有TSS，引物设计在TSS之前。
: 4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用
|
s******y
发帖数: 17729 | 53 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
Seq
exon
【在 x********e 的大作中提到】
: 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
: 等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
: 2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
: 土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
: template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
: library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
: 后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
: 3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
: 有TSS，引物设计在TSS之前。
: 4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用
|
y*********u
发帖数: 183 | 54 promoter reporter这种实验还有人在做啊，灌水么？什么年代了。
要看regulatory elements 就看至少一个sub TAD的
promoter clone这种东西嘛反正拿到的结果都是technique artifact，也无所谓怎么做
了，真的。
路子
【在 s******y 的大作中提到】
: 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
: 正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
: 你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
: 虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
:
: Seq
: exon
|
x********e
发帖数: 35261 | 55 不是所有人做的东西都能搞到HiC data。另外，genomic approach没有in vivo证明没
有实际意义。你也不知道别人做promoter reporter的目的是啥啊。
【在 y*********u 的大作中提到】
: promoter reporter这种实验还有人在做啊，灌水么？什么年代了。
: 要看regulatory elements 就看至少一个sub TAD的
: promoter clone这种东西嘛反正拿到的结果都是technique artifact，也无所谓怎么做
: 了，真的。
:
: 路子
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x********e
发帖数: 35261 | 56 你需要更新一下你的思维。PCR普及之前的确都是用酶切做克隆。
路子
【在 s******y 的大作中提到】
: 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
: 正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
: 你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
: 虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
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: Seq
: exon
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