i*****i
发帖数: 154 | 1 现在手里的一个课题，想继续做一些生化方面的研究。
已知蛋白E可以和我的目的蛋白L结合。基于各种实验中遇到的痛苦经验，以及对蛋白L
的序列结构分析（存在大量磷酸化motif），我认为蛋白E与蛋白L的结合可以稳定蛋白L
。但是随着时间的推移，加诸其他的外界条件，这个L仍然会被磷酸化。
现在我想证明
1）蛋白E与L的结合，增加了L的稳定性（已知E非常稳定）
2）这种稳定性来源于阻止了某些位点的磷酸化
3）如何证明某一个pathway（AKT or ERK or ...)是负责这个蛋白磷酸化的。
请问版上的生化牛人，怎么设计一些实验来证明呢？ |
a*****x
发帖数: 901 | 2 Just my two cents, not in the field...
1) pulse chase (fluore or isotope) or CHX treatment or SNAP tag with or
without over-expression of E (or knock-down)
2) Phospho versus dephospho mimic mutation; If the sites are not clear, try
to look for phospho change by over-expression of E (or knock-down)
3) specific inhibitors |
o**d
发帖数: 3080 | 3 1， 表达E，L ，E＋L，看看有E的情况下L是否更稳定（首先假设E和L在293cell里是能
结合的。而且你需要很多control，来证明这个由于蛋白的稳定性造成的）。也可以用E
的KO 或KD细胞来看L是否更不稳定。
2，突变你认为的L上的磷酸化位点，重复实验1，
3，先查一下有没有人报道L被AKT 或ERK磷酸化。然后看看AKT／ERK KO （KD） cell里
L的磷酸化是否降低（如果有磷酸化抗体的话）。还可以看L是否更稳定。
L
白L
【在 i*****i 的大作中提到】
: 现在手里的一个课题，想继续做一些生化方面的研究。
: 已知蛋白E可以和我的目的蛋白L结合。基于各种实验中遇到的痛苦经验，以及对蛋白L
: 的序列结构分析（存在大量磷酸化motif），我认为蛋白E与蛋白L的结合可以稳定蛋白L
: 。但是随着时间的推移，加诸其他的外界条件，这个L仍然会被磷酸化。
: 现在我想证明
: 1）蛋白E与L的结合，增加了L的稳定性（已知E非常稳定）
: 2）这种稳定性来源于阻止了某些位点的磷酸化
: 3）如何证明某一个pathway（AKT or ERK or ...)是负责这个蛋白磷酸化的。
: 请问版上的生化牛人，怎么设计一些实验来证明呢？
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g*********5
发帖数: 2533 | 4 1.大量磷酸化motif..
你先比较下同源蛋白，做个clustalw
先研究保守的。
2.L truncate form，看那一段和E结合。磷酸化位点应该在结合的那段上
pulse chase (fluore or isotope)， fluore如何做？谢谢。 |
