b*********8 发帖数: 44 | 1 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western,结果是白板,
是怎么回事? 大家有人用过这个抗体吗, 因为一抗本身就带了HRP,所以就不用二抗
了,不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏? |
m******5 发帖数: 1383 | 2 我也用这株抗体,凑合的
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western,结果是白板, : 是怎么回事? 大家有人用过这个抗体吗, 因为一抗本身就带了HRP,所以就不用二抗 : 了,不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏?
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d******u 发帖数: 99 | 3 你确定你转基因植物里HA fusion蛋白表达吗 |
c********b 发帖数: 363 | 4 我也是在植物中蛋白表达,用的一样得抗体,WB和IP都非常好用,我用的1:1000的浓
度,还可以重复回收用一次。
你是怎么表达得蛋白的,转基因还是瞬时表达?蛋白定位在哪里?用的positive
control是什么?
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western,结果是白板, : 是怎么回事? 大家有人用过这个抗体吗, 因为一抗本身就带了HRP,所以就不用二抗 : 了,不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏?
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m*******n 发帖数: 387 | 5 这种情况我们遇过,就是那批次出了问题
直接让他们送个新的就可以了
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western,结果是白板, : 是怎么回事? 大家有人用过这个抗体吗, 因为一抗本身就带了HRP,所以就不用二抗 : 了,不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏?
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b*********8 发帖数: 44 | 6 谢谢楼上几位的回复。我是在烟草中做的瞬时表达'都出表型了'所以肯定是表达的'都
让他们送过第二次抗体了,结果还是白板'都不知道怎么办了。不会这次还有问题吧?可
惜我没有阳性对照'那里可以弄到对照呀?不过转膜肯定没有问题的'marker都转过去了 |
a******8 发帖数: 56 | 7 This antibody is super good in our hand. We used 1:10000 dilution and still
get strong signal. A pos ctrl is a must have.
You may also want to confirm the second batch you got had different lot#
from the first one. |
c********b 发帖数: 363 | 8 我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察,然后在FISU,那个比你做western难多
了。出现表型不是什么好事,应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于
agroinfiltration (Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by
Agroinfiltration Transient Expression),里面提到了关于植物需要的适宜条件。
首先植物需要种在23-25度,打完植物需要放在22度左右光照12小时以上,持续光照有
利于表达。另外,这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索
。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就
一般表达效率要低(在烟草中)。最好的是GV2260,我刚发帖去求了,我的一个HA
fusion蛋白也是表达很低(绝对不是抗体问题,positive control每次都work)。
你先找个postitive control,随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有
positive control,no control no experiment。而且你的是大蛋白,转膜比较难,不
能完全用marker做一个衡量,有可能还要调整transfer buffer。你可以参考一下abcam
的western for beginner,里面都有。
最后你的蛋白在哪里定位也很重要,你应该先预测一下。如果是膜蛋白你最好enrich
membrane
fraction,如果是核蛋白要enrich nuclei,细胞质蛋白就很容易,一般都能看到,除
非表达量特
别低。植物的核蛋白如果是DNA结合的又更难了,提取液中加1%的SDS几乎是必须的。
如果是
膜蛋白上样不要加热(最多65度10 min)。
最后一个题外话,我知道很多例子都是GFP融合蛋白在植物里面表达比小tag的更好,之
所以很多人不能用GFP来表达是因为出现了mislocalization或者complement的时候失败
了。所以你这个例子gfp反而表达更少(没有表型)我表示怀疑。
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢楼上几位的回复。我是在烟草中做的瞬时表达'都出表型了'所以肯定是表达的'都 : 让他们送过第二次抗体了,结果还是白板'都不知道怎么办了。不会这次还有问题吧?可 : 惜我没有阳性对照'那里可以弄到对照呀?不过转膜肯定没有问题的'marker都转过去了
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b*********8 发帖数: 44 | 9 非常感谢centuribob的详细解答!
我用的菌株是GV3101, 有的加了P19, 有的没有加, 并且在24, 48h 不同时间点取
的样,结果都没有信号。 我的蛋白也属于 NB-LRR , 在48h 就能看到轻微的细胞死亡
表型,72-96h后更明显,所以应该是蛋白表达没有问题。
另外,我的蛋白根据预测应该是细胞质和细胞核都有的,不是很肯定,所以想用GFP看
定位,但没有信号,也没有细胞死亡的表型。不知道是不是由于蛋白太大的缘故。
请问centuribob能否把你的带HA的载体借我做对照?因为如果我自己做一个,我不确定
会不会work. 非常感谢!
【在 c********b 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察,然后在FISU,那个比你做western难多 : 了。出现表型不是什么好事,应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于 : agroinfiltration (Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by : Agroinfiltration Transient Expression),里面提到了关于植物需要的适宜条件。 : 首先植物需要种在23-25度,打完植物需要放在22度左右光照12小时以上,持续光照有 : 利于表达。另外,这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索 : 。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就 : 一般表达效率要低(在烟草中)。最好的是GV2260,我刚发帖去求了,我的一个HA : fusion蛋白也是表达很低(绝对不是抗体问题,positive control每次都work)。 : 你先找个postitive control,随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有
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t*****P 发帖数: 36 | 10
技术贴,sp!
【在 c********b 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察,然后在FISU,那个比你做western难多 : 了。出现表型不是什么好事,应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于 : agroinfiltration (Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by : Agroinfiltration Transient Expression),里面提到了关于植物需要的适宜条件。 : 首先植物需要种在23-25度,打完植物需要放在22度左右光照12小时以上,持续光照有 : 利于表达。另外,这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索 : 。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就 : 一般表达效率要低(在烟草中)。最好的是GV2260,我刚发帖去求了,我的一个HA : fusion蛋白也是表达很低(绝对不是抗体问题,positive control每次都work)。 : 你先找个postitive control,随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有
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