g***j
发帖数: 40861 | 1 怎么把一个2000 多的片段连到一个7000多的载体上，每次都连得稀奇古怪的？ |
b*****o
发帖数: 150 | 2 Should be pretty easy. What's your mean "每次都连得稀奇古怪的"?
Is your 2000bp DNA fragment PCR product? or released from another vector?
Are KpnI and HindIII very close to each other? Provide more information if
you really want to get help |
g***j
发帖数: 40861 | 3 是应该很简单啊
2000的片段是从别的质粒上消化下来的
两个酶切位点在载体上相距800吧
每回连出来的质粒都比消化过的载体还小，每回还都不一样。
我就奇了怪了。 |
b*****o
发帖数: 150 | 4 我有一同事，从一个要来的载体上双切连一个片段，却怎么也连不上。一会认为酶有问
题，一会认为KIT有问题。我建议他首先搞清楚是不是还有其他的酶切位点，就是是否
是特异的一个切点。不要完全以来于提供载体人的信息。他分别切后，发现其中一个酶
有两个酶切位点，这个酶切出的片段大小和他用两个酶切出的是一样的。这说明这个酶
有一个位点在另外外一个酶位点里面，而且靠的很近。后来测序发现果然是这样。原理
做这个载体的人离开那个实验室，而后来的人根据他的NOTEBOOK做了个图，这个酶切位
点给漏掉了。也就是说他每次同时放两个酶同时切，其实最后两端是同一个酶切位点。
后来找了另外一个在最里面的酶做克隆，一次成功。
希望通过这个故事能解决你的问题。 |
