y***y 发帖数: 709 | 1 有一个蛋白,预测到多个磷酸化位点
想看看都什么激酶作用这些位点,不知道kinase profiling是不是能达到这个目的。
看到很多公司有这个sevice,不知板上是否有人用过这个sevice,效果怎么样?那个公
司比较靠谱?大概收费是多少? |
p*****e 发帖数: 93 | 2 put in GPS 2.1 (a free software), it will tell you the potential kinases.
【在 y***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有一个蛋白,预测到多个磷酸化位点 : 想看看都什么激酶作用这些位点,不知道kinase profiling是不是能达到这个目的。 : 看到很多公司有这个sevice,不知板上是否有人用过这个sevice,效果怎么样?那个公 : 司比较靠谱?大概收费是多少?
|
y***y 发帖数: 709 | 3 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。
可预测出来的潜在位点太多了,我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的
激酶筛出来。
【在 p*****e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : put in GPS 2.1 (a free software), it will tell you the potential kinases.
|
S*********s 发帖数: 304 | 4 我觉得你这个jump太多了
至少要先确定是哪个点被phosphorylated了吧?
是不是functional的?
www.phosphosite.org里面可以查查MS data
In vitro kinase profiling我总觉得很不特异
【在 y***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。 : 可预测出来的潜在位点太多了,我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的 : 激酶筛出来。
|
y***y 发帖数: 709 | 5 我们已经做了MS确认了几个位点的磷酸化
可是不知道到底是什么激酶磷作用这几个位点
所以我就想,kinase profiling是不是可以把作用这几个位点的激酶筛到
我之前没有接触过激酶这一块的研究,才会来这里问大家
有一个叫taxolx(紫杉醇)的朋友给我来信,告诉我说kinase profiling是指特定激酶
抑制剂的profiling。
我感到很汗颜,连基本概念都没弄清楚-_-!
【在 S*********s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得你这个jump太多了 : 至少要先确定是哪个点被phosphorylated了吧? : 是不是functional的? : www.phosphosite.org里面可以查查MS data : In vitro kinase profiling我总觉得很不特异
|
S*********s 发帖数: 304 | 6 Then you can do
1)in vivo crosslink
可以用非特异的crosslinker
or You can try photo-activated leucine
2)MS identification
【在 y***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们已经做了MS确认了几个位点的磷酸化 : 可是不知道到底是什么激酶磷作用这几个位点 : 所以我就想,kinase profiling是不是可以把作用这几个位点的激酶筛到 : 我之前没有接触过激酶这一块的研究,才会来这里问大家 : 有一个叫taxolx(紫杉醇)的朋友给我来信,告诉我说kinase profiling是指特定激酶 : 抑制剂的profiling。 : 我感到很汗颜,连基本概念都没弄清楚-_-!
|
y***y 发帖数: 709 | 7 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗?
我们已经做了MS,并确认了几个位点确实有磷酸化
我坐在这里想象一下:
如果有这么一种slide,上面点着各种不同激酶的特异性抗体,当用激酶的混合物和
slide杂交之后,激酶就会结合在各自的抗体之上,洗掉激酶混合物以及非特异性结合
之后,放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中,一段时间后加蛋白交联剂,把和激酶作用
的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上,洗脱,扫片子,有标记信号的点表示该抗体所
对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。
这个实验能够实现的话,那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋
白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话,尽管拿这个
idea去研发,我不收专利费,哈哈
【在 S*********s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Then you can do : 1)in vivo crosslink : 可以用非特异的crosslinker : or You can try photo-activated leucine : 2)MS identification
|
S*********s 发帖数: 304 | 8 恩,你还需要做的一件事就是确认那些posphorylation site是重要的,有功能的。
你需要做
knockdown, then rescue with S/T to A mutant and S/T to D/E mutant.
因为很多磷酸化位点虽然发生了,但是没功能。
你想象的想法很好,一不需要抗体,公司一般直接是把tagged kinase放在slide上
二。这个实验很dirty, kinase能磷酸化很多蛋白,特异性不够。
我说的是in vivo crosslink,用你的蛋白把kinase拉下来,但没有那么容易做。
我的感觉是,你需要多读一些kinase研究相关的paper.
Good luck.
【在 y***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗? : 我们已经做了MS,并确认了几个位点确实有磷酸化 : 我坐在这里想象一下: : 如果有这么一种slide,上面点着各种不同激酶的特异性抗体,当用激酶的混合物和 : slide杂交之后,激酶就会结合在各自的抗体之上,洗掉激酶混合物以及非特异性结合 : 之后,放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中,一段时间后加蛋白交联剂,把和激酶作用 : 的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上,洗脱,扫片子,有标记信号的点表示该抗体所 : 对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。 : 这个实验能够实现的话,那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋 : 白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话,尽管拿这个
|
b****u 发帖数: 2771 | 9 curious question: what is time scale for kinase and substrate binding.
【在 S*********s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Then you can do : 1)in vivo crosslink : 可以用非特异的crosslinker : or You can try photo-activated leucine : 2)MS identification
|
p*****e 发帖数: 93 | 10 Check whether the phosphorylation sites match the phosphorylation motif of
these potential kinases.
【在 y***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。 : 可预测出来的潜在位点太多了,我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的 : 激酶筛出来。
|
S*********s 发帖数: 304 | 11 many kinase/substrate interaction is transient
can not get interaction by IP unless using crosslinker
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : curious question: what is time scale for kinase and substrate binding.
|