L******e
发帖数: 679 | 1 My boss want me to find out exactly how many protein kinases (among them,
how many tyrosine kinases and serine/threonine kinases) and lipid kinases in
human beings.
I chekced several references and a website " www.kinase.com'
I got the follows:
1, 518 kinases. 90 are Tyrosine kinases.
I cannot find the number of serine/threonine kinases and lipid kinases, even
though i searched many published papers.
Roughly, the protein kinase was mainly classified as TK and STK, but there
is still some other |
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b******y
发帖数: 627 | 2 Some kinases auto-phosphorylate. If you eventually get protein, either
through recombination or IP, try to incubate it at high concentration in the
presence of p32-ATP and Mg2+ and auto-radiography to see whether your
protein auto-phosphorylate itself.
However, bioinformatics are pretty powerful. If it says that it is S/T
kinase with high confidence, it is. However, substrates of kinase are non-
trivial to find for three reasons: 1) interactions between kinases and their
substrate are mostly tra... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 3 Some kinases auto-phosphorylate. If you eventually get protein, either
through recombination or IP, try to incubate it at high concentration in the
presence of p32-ATP and Mg2+ and auto-radiography to see whether your
protein auto-phosphorylate itself.
However, bioinformatics are pretty powerful. If it says that it is S/T
kinase with high confidence, it is. However, substrates of kinase are non-
trivial to find for three reasons: 1) interactions between kinases and their
substrate are mostly tra... 阅读全帖 |
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t****p
发帖数: 1504 | 4 由于kinase和substrate的binding是transient and weak 的，所以这一直是个难题。
1. 直接binding，yeast-two hybrid，或通过complex中找到。这些报道很少，一般
是找到后用来确证的确直接binding。
2. 根据已知的substrate中磷酸化位点序列的保守性来scan，推测，猜。
3. 猜：两个蛋白功能很接近，看是否直接binding，是否磷酸化。
4. 用peptide array：体外纯化的kinase，看对哪些peptide的磷酸化活性高，根据
peptide的序列scan，再体内验证。
5. 2-D胶。敲除某个kinase，看哪些蛋白的磷酸化发生变化。再质谱鉴定。
6. inhibitor array：现在有很多专门针对某个kinase的小分子inhibitor，把这些
inhibitor收齐全了，如果有某个substrate的磷酸化抗体，就用inhibitor筛一遍，看
哪个抑制强。
7. ……看我的第二篇文章：鼓吹phosphoproteomics的文章……
欢迎补 |
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h**********y
发帖数: 18 | 5 我做过一个实验，不是MAPK，用的是MAP2K，
发现在in vitro kinase的条件下，MAP2K自己就可以autophosphorylation，我猜想
MAPK应该也会是类似的情况，毕竟体外的实验总是有一些artifact。另外，看早期的
MAPK的paper，他们的in vitro kinase assay是不需要加入MAP2K的。当然加入MAP2K之
后，对MAPK底物的磷酸化会强很多。
另外，你在你的kinase里面有没有加入DTT？我们发现某些kinase因为某些特定位置的
aa，对DTT是敏感的。而ERK在相应的位置恰好存在一个这样的aa |
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g*****n
发帖数: 241 | 6 我在E. coli里面表达两种不同的receptor tyrosine kinase的kinase domain，结果一
个有tyrosine kinase activity，一个没有。请问这种情况常见吗？该怎么优化才能使
得它有kinase activity啊？
谢谢！ |
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v***a
发帖数: 1242 | 7 在做一个作用广泛的protein kinase在某相对封闭的生物系统中的作用。这个kinase在
N多biological functions中都神通广大，可以激活很多的信号通路，还可以recruit很
多的蛋白（包括其它kinase和膜蛋白）。关于这个蛋白，我现在的lab已经做了很多工
作，有好几篇paper。现在老板叫我继续做，他的想法是把这个蛋白knock down，还有
用site-directed mutagenesis搞一个constitutive activated/inactivated form。但
这个方法已经被lab做其它protien的，还有做相似kinase的用烂了。而且我想这个蛋白
本身功能广泛，肯定会牵动很多的通路，最后的变化反而不好确定，解释起来也复杂多
多。
想听听大家的想法？还有其它研究的好点子吗。谢谢～～ |
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S*********s
发帖数: 304 | 8 恩，你还需要做的一件事就是确认那些posphorylation site是重要的，有功能的。
你需要做
knockdown, then rescue with S/T to A mutant and S/T to D/E mutant.
因为很多磷酸化位点虽然发生了，但是没功能。
你想象的想法很好，一不需要抗体，公司一般直接是把tagged kinase放在slide上
二。这个实验很dirty, kinase能磷酸化很多蛋白，特异性不够。
我说的是in vivo crosslink，用你的蛋白把kinase拉下来，但没有那么容易做。
我的感觉是，你需要多读一些kinase研究相关的paper.
Good luck. |
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h**********a
发帖数: 72 | 9 IkB kinase type b与磷酸化的IkB kinase type b，在同样的样本里，是应该表达相反
的吗？
也就是如果IkB kinase type b表达高，磷酸化的IkB kinase type b就应该表达量低，
是这样的吗？ |
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e**r
发帖数: 1144 | 10 真核细胞里 Ser/Thr Kinase一般都是有很多底物的吧？
有没有只特异磷酸化某一两个蛋白的kinase？
还有，Kinase的特异性主要是Kinase domain决定的还是recruit决定的？ |
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c**********r
发帖数: 109 | 11 phosphatidylinositol 3-kinase or Phosphoinositide 3-Kinase
which one is correct? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 请注意你的用词
>Xuemei又不做抗性和kinase
是"和"而不是"或"
then
what is this?
a)
her Vita:
19. Wenming Wang and Xuemei Chen. HUA ENHANCER3 reveals a role for a
cyclin-dependent protein kinase in the specification of floral organ
identity in Arabidopsis. (2004) Development 131, 3147-
from
//www.plantbiology.ucr.edu/faculty/chen.html
and her review article:
b)
//www.springerlink.com/content/p22k662q1162kp07/
and this:
c)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20675573
Plant Cell. 2010 Jul;22(7):2156-
Orchestration of the f... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 请注意你的用词
>Xuemei又不做抗性和kinase
是"和"而不是"或"
then
what is this?
a)
her Vita:
19. Wenming Wang and Xuemei Chen. HUA ENHANCER3 reveals a role for a
cyclin-dependent protein kinase in the specification of floral organ
identity in Arabidopsis. (2004) Development 131, 3147-
from
//www.plantbiology.ucr.edu/faculty/chen.html
and her review article:
b)
//www.springerlink.com/content/p22k662q1162kp07/
and this:
c)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20675573
Plant Cell. 2010 Jul;22(7):2156-
Orchestration of the f... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 14 她postdoc老板是做花的顶尖人物，这两篇提到了kinase，但是focus是花啊.
我没有说我对她特别了解，但是我觉得focus在kinase或抗性是要关注机理，而你提到
的例子都是在关注别的机理时提到了kinase,所以不能算她的focus.
至于你怎么想的，我没兴趣。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 15 要买recombinant CDK kinase enzyme, 最好是Xenopus or human的。请大家推荐一个，
做kinase assay |
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v***a
发帖数: 1242 | 16 一个non-receptor tyrosine kinase，在我进行某种与cell migration有关的诱导后，
它的protein level下降了，但它其它的磷酸化形式都没有变化（WB结果）。根据其它
的条件，实验中的cell migration应该增加，但我查了很多文献，几乎所有的
reference都说这个non-receptor tyrosine kinase的protein level下降的话是因为
cell migration减少。
难道是我的观察有误吗？但实验重复来重复去，结果都高度一致，真是想不通啊！上来
问问大家，看看有没有遇到类似情况的？ |
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y*******a
发帖数: 303 | 17 如题，已知一个基因的信息，prediction是Serine/threonine-protein kinase，但不
知道substrate，怎样从实验的角度证明是protein kinase? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 Continue to 18th floor
not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs:
References:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22312265
more
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15565159
original hint from:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31644341.html
NB: if HIV treatment is not relative to 抗性和kinase
Are you sure? centuribob (Planta)
回复]
[ 20 ]
发信人: centuribob (Planta), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样设计小实验来确定一个基因编码的蛋... 阅读全帖 |
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y*******a
发帖数: 303 | 19 如题，已知一个基因的信息，prediction是Serine/threonine-protein kinase，但不
知道substrate，怎样从实验的角度证明是protein kinase? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 Continue to 18th floor
not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs:
References:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22312265
more
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15565159
original hint from:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31644341.html
NB: if HIV treatment is not relative to 抗性和kinase
Are you sure? centuribob (Planta)
回复]
[ 20 ]
发信人: centuribob (Planta), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样设计小实验来确定一个基因编码的蛋... 阅读全帖 |
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s*******g
发帖数: 5 | 21 请问能不能Co-IP的方法检测某个蛋白是不是和这个kinase相互作用。考虑到酶和底物
作用的瞬时性，不知道能不能用Co-IP的方法检测到这个相互作用。
关于kinase和底物的Co-IP有什么和普通Co-IP不同的地方吗？
多谢了。 |
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y*******a
发帖数: 303 | 22 我最近一直在克隆一个protein kinase gene，连在T-easy vector 上还挺轻松，然后
通过粘性末端切下来， 和pCambia binary vector 相连转入E.Coli后就出现问题了。
有时候菌很难长，有时候长的size正常，做colony PCR没有，以为是gene 太长（3.5kb
）普通的Taqpolymerase很难PCR出来，所以用基因的部分片段PCR，colony PCR都有条
带。提取plasmid后酶切总是很乱，所幸去测序，但都是没测序结果。请问是不是
protein kinase的表达会影响E.coli？
非常感谢！ |
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y***y
发帖数: 709 | 23 我们已经做了MS确认了几个位点的磷酸化
可是不知道到底是什么激酶磷作用这几个位点
所以我就想，kinase profiling是不是可以把作用这几个位点的激酶筛到
我之前没有接触过激酶这一块的研究，才会来这里问大家
有一个叫taxolx（紫杉醇）的朋友给我来信，告诉我说kinase profiling是指特定激酶
抑制剂的profiling。
我感到很汗颜，连基本概念都没弄清楚-_-! |
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a****l
发帖数: 125 | 24 知道了一个蛋白的磷酸化位点, 也有特异抗体可以识别这个磷酸化位点. 这蛋白在细胞
里过表达后就会有这个位点的磷酸化. 请问用什麽方法找到正确的kinase? 最好是比较
简单易行的.
多谢 |
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p*****9
发帖数: 32 | 25 想用kinase inhibitor 去 treat 细胞, 看phosphorylation 的变化. 知道IC50, 但我
想IC50 都是用in vitro 方法测得的, 真要加在细胞上用多少浓度呢? 应该和IC50 一
样吗? 看了一些文章, 好象treat 细胞的浓度都比IC50 大. 可大了又会有specificity
的问题. 大家都是如何解决的?
多谢 |
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v***a
发帖数: 1242 | 26 tyrosine kinase除了可以phosphorylate tyrosine residues，还能phosphorylate其
它的residues吗？比如Threonine和Serine？谢谢！ |
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j***i
发帖数: 39 | 27 做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
不知道那位有好的idea? |
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j***i
发帖数: 39 | 28 谢谢hanchenjammy的分享。
1）我用了1mM DTT在Kinase Buffer。这次我去掉DTT试试；
2）“当然加入MAP2K之后，对MAPK底物的磷酸化会强很多” EK293T中才纯化的ERK2,收
细胞前，用EGF刺激细胞，让EKR磷酸化，所以可以替代加MAP2K；
3）我发现分子量很小的一个位置（20Kd?），有信号，而对照点突变没有，可能是降解
产物。所以在想：是不是全长不容易被磷酸化？降解的反而暴露出位点？
有没有新的结果，给告详解。 |
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r****i
发帖数: 323 | 29 哪位大牛知道有没有non-specific protein kinase inhibitor。
在线等， 多谢 |
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l******a
发帖数: 3339 | 30 2种可能，最可能的是这个domain需要其他的domain连着才能有活性。另一种是self
phosphorylation而失活。你最好还是说出来到底是那个kinase，因为这也是case by
case,
也许有人能帮你。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 31 谢谢你的建议。
我表达的是insulin receptor的kinase domain，按理说应该有auto-phosphorylation
的，但不知道为什么就是检测不到。 |
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m****g
发帖数: 530 | 32 哥哥姐姐们，
小弟想知道在budding yeast kinome (122 kinases)又多少是essential的， 但是差了
半天， 只有fission yeast的，没有budding yeast 的， 感觉上不太可能， 不知那位
知道这方面的信息， 给片文献？
多谢 |
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X******n
发帖数: 914 | 33 About 127 Kinases in budding yeast, 15 of them are essential. |
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X******n
发帖数: 24 | 34 想做 PKR in vitro kinase assay, 从没做过这类试验，请帮忙推荐一个好用的 kit.
非常感谢！ |
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X******n
发帖数: 24 | 35 想做 PKR in vitro kinase assay, 从没做过这类试验，请帮忙推荐一个好用的 kit.
非常感谢！ |
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c********e
发帖数: 124 | 37 刚刚纯化了一个kinase, 想测一下活性，请推荐一个简单好用的kit,最好不要用同位素
的。非常感谢！ |
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y*******a
发帖数: 303 | 38 我刚入行生物一年多，生化知识薄弱，自己的project 是protein kinase～ |
|
y*******a
发帖数: 303 | 39 可是我的这个protein kinase gene 是新的，目前data base上已经可以得到cDNA, 但
是protein还没得到，是不是就没有办法缩小范围了呢？ |
|
y*******a
发帖数: 303 | 40 谢谢你的回复，对我很有帮助啊。我project的主要目的是分析这个新的kinase gene可
不可以提高植物的抗性，主要做的是transgenic plants 的physiology analysis， 只
是老板提出来了。。。
the
their
and |
|
|
c********b
发帖数: 363 | 42 Xuemei又不做抗性和kinase，人家做小RNA的代谢
project: |
|
c********b
发帖数: 363 | 43 I did not see your logic.
I was saying Xuemei did not work on Kinase and resistance. Did her group
publish original research report on HIV?? I bet she has no permission to
work on HIV yet. I will meet her this May, and I can ask her if you want me
to.
As for myself, I am a pure RNA biologist. I work on miRNA, non coding
pathogen RNA, circular RNA, etc. I guess I am pretty familiar with
literatures in plant RNA biology. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20023165
full text link:
//www.weigelworld.org/research/publications/2010/pdfs/Rodriguez%
20Development%202010.pdf
even Xue-mei Chen before 2010 never did Arabidopsis cyclin-dependent
kinases and microRNA
after 2011 she should noted that paper.
And You centuribob (Planta) from 2012 now still ignored it? |
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y*******a
发帖数: 303 | 45 我刚入行生物一年多，生化知识薄弱，自己的project 是protein kinase～ |
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y*******a
发帖数: 303 | 46 可是我的这个protein kinase gene 是新的，目前data base上已经可以得到cDNA, 但
是protein还没得到，是不是就没有办法缩小范围了呢？ |
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y*******a
发帖数: 303 | 47 谢谢你的回复，对我很有帮助啊。我project的主要目的是分析这个新的kinase gene可
不可以提高植物的抗性，主要做的是transgenic plants 的physiology analysis， 只
是老板提出来了。。。
the
their
and |
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c********b
发帖数: 363 | 49 Xuemei又不做抗性和kinase，人家做小RNA的代谢
project: |
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c********b
发帖数: 363 | 50 I did not see your logic.
I was saying Xuemei did not work on Kinase and resistance. Did her group
publish original research report on HIV?? I bet she has no permission to
work on HIV yet. I will meet her this May, and I can ask her if you want me
to.
As for myself, I am a pure RNA biologist. I work on miRNA, non coding
pathogen RNA, circular RNA, etc. I guess I am pretty familiar with
literatures in plant RNA biology. |
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