L****e
发帖数: 499 | 1 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
多谢了 |
g***y
发帖数: 205 | 2 如果你的蛋白是histine kinase，我觉得最简单的实验应该是in vitro
phosphorylation.
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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s*****r
发帖数: 7 | 3 首先，你的蛋白是多位点磷酸化的,先用anti-Pser做IP,不管wild type和mutant可能都
会抓下来,后面的blot还是没区别.
建议：
1 现在有个叫phostag的试剂，可以通过SDS-PAGE条带区别出不同磷酸化状态，在配胶
的时候加入，run gel后用你蛋白的抗体blot，用这个可以粗略分析。
2 如果想知道突变影响的具体磷酸化位点，那可以就把两个蛋白表达纯化出来，typsin
酶解后找个kit（GL sciences，Sigma，Promega等）提取磷酸肽，然后上质谱鉴定各自
的磷酸化位点吧。
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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f*****t
发帖数: 901 | 4 试试LC/MS
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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d**c
发帖数: 588 | 5 用普通的抗体把wt 和 mutant先IP下来，
然后做in-vitro phosphorylation assay, 实际上是个back phosphorylation assay,
做出来哪个phosphorylation信号多的，原来phosphorylation水平低， 当然你得知道
做什么phosphorylation，用什么酶， 是PKA还是别的。
如果总体水平有区别， 再一个一个位点做mutation， 重复back phosphorylation
assay.
这是个费时费力的笨办法， very old school.
anti-phosphoserine ab 用过的都不work。 |
p*****p
发帖数: 19331 | 6 你需要先考虑的是,你期待这个突变会引起什么样下游反应.要是屁下游作用都没有,磷
酸化做得再漂亮都没用.
做磷酸化,最简单的就是把所有抗体买来试,不要说不可能,这是最方便的,如果可以,你
可以问他们要sample，你只要付运费。
不行就做phos-tag，不过，不向他们宣传的那么好做
最可靠的就是in vivo labeling,不是in vitro kinase assay,不过需要用同位素，很
多人都不愿意做。
pan-phospho的抗体，貌似只有p-tyr的好用，而且还必须是4G10
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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K******S
发帖数: 10109 | 7 routine proteomics work
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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d***8
发帖数: 17 | 8 Easy thing. Just send the sample to proteomics facility. Make sure you
follow the instructions when preparing your sample.
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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w******c
发帖数: 37 | 9 isoelectrical focusing 等电聚焦电泳 |
r******t
发帖数: 135 | 10 1. LC/MS/MS
2. Peptide Mapping
3. Mutate and observe functional change |
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L****e
发帖数: 499 | 11 多谢诸位，一觉起来发现这么多有营养的回复，其实这个实验就是自己拍脑袋想出来的
，突变引起的下游的效应，比如一系列的基因表达的变化都有了，这个蛋白是个核因子
，现在就是想搞清楚为什么这个突变引起了这么多下游很重要的基因表达的变化。
小实验室，没钱，买个抗体几百块钱都要想很久，所以很花钱的计划就不在考虑之列，
现在想尝试一下phos-tag， sunnymor和 ppANDpp兄弟相必对这个 phos-tag 很有经验
，能否分享一下。多谢
我看很多年前的文献有的用的 30p做in vivo labeling，好像很麻烦，现在主要是对是
不是磷酸化引起的突变蛋白影响转录还没有一点苗头，所以不敢花很多金钱和时间往下
做。
ANY WAY, 十分感谢各位的回复，祝你们的实验一切顺利 |
l***y
发帖数: 4671 | 12 试试这个？
http://www.kinativ.com/technology.html
就是当年的 ActivX 那个系统。大意就是把所有磷酸位点都用 tagged ATP or ADP 来
不可逆地 label 上，然后做 MS 看都有哪些 protein 被 ATP/ADP tag 给标定了。如
果你有很好的 antibody 来把想要的 protein 给抓下来，而不是拿所有的 protein 来
做 MS，同时用 wt 做 control，那就一目了然了。前年打过电话，公司说这个系统可
以做 live。
要想看 mutant 对下游的影响，做个标准的 functional proteomics 甚至 mRNA
microarray 就好了 -- 跟 wt 对照。
IP
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
: 是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
: 点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
: 抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
: 我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
: ，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
: 出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
: Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
: 我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
: 没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
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K******S
发帖数: 10109 | 13 所有磷酸位点都用 tagged ATP or ADP 来不可逆地 label 上
this is actually not true from the website you provided. It labels the lys
close to the ATP/ADP binding site. It's very different than phosphorylation
site.
【在 l***y 的大作中提到】
: 试试这个？
: http://www.kinativ.com/technology.html
: 就是当年的 ActivX 那个系统。大意就是把所有磷酸位点都用 tagged ATP or ADP 来
: 不可逆地 label 上，然后做 MS 看都有哪些 protein 被 ATP/ADP tag 给标定了。如
: 果你有很好的 antibody 来把想要的 protein 给抓下来，而不是拿所有的 protein 来
: 做 MS，同时用 wt 做 control，那就一目了然了。前年打过电话，公司说这个系统可
: 以做 live。
: 要想看 mutant 对下游的影响，做个标准的 functional proteomics 甚至 mRNA
: microarray 就好了 -- 跟 wt 对照。
:
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l***y
发帖数: 4671 | 14 啊。。。你说的对。。。标的是 kinase。
phosphorylation
【在 K******S 的大作中提到】
: 所有磷酸位点都用 tagged ATP or ADP 来不可逆地 label 上
: this is actually not true from the website you provided. It labels the lys
: close to the ATP/ADP binding site. It's very different than phosphorylation
: site.
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p*****p
发帖数: 19331 | 15 in vivo labeling不麻烦，而且很便宜
关键是你实验室要有license,用磷32，能够看整体磷酸化水平。
phos-tag我接触过，光跑胶难度就不小，厂家的protocal都在变化。最后能达到的最理
想效果就是接近in vivo labeling的能力。
in vivo label之后，sample可以做磷酸化氨基酸分析，你就能知道是哪一种氨基酸磷
酸化了。然后可以用trypsin消化label的样品，做2D mapping......不过这一套做下来
也很费工夫。
搞research就是很费工夫。没有办法，光想没有用。
你还是先要免费抗体好了，要到几个是几个。打电话给这些公司，准备好fedex帐户，
大多数公司会免费送你一点，足够你做几次western的，但是肯定不会free shipping给
你。
【在 L****e 的大作中提到】
: 多谢诸位，一觉起来发现这么多有营养的回复，其实这个实验就是自己拍脑袋想出来的
: ，突变引起的下游的效应，比如一系列的基因表达的变化都有了，这个蛋白是个核因子
: ，现在就是想搞清楚为什么这个突变引起了这么多下游很重要的基因表达的变化。
: 小实验室，没钱，买个抗体几百块钱都要想很久，所以很花钱的计划就不在考虑之列，
: 现在想尝试一下phos-tag， sunnymor和 ppANDpp兄弟相必对这个 phos-tag 很有经验
: ，能否分享一下。多谢
: 我看很多年前的文献有的用的 30p做in vivo labeling，好像很麻烦，现在主要是对是
: 不是磷酸化引起的突变蛋白影响转录还没有一点苗头，所以不敢花很多金钱和时间往下
: 做。
: ANY WAY, 十分感谢各位的回复，祝你们的实验一切顺利
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