K*C
发帖数: 2825 | 1 做了个蛋白的mutant，换了200个bp左右，结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
倍。然后做了一下
qPCR，发现是RNA的问题，RNA量下降了64倍。
然后我把这个mutant的200bp分成了3段，每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type，把上面3段中其中一段突变
到mutant的序列，结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
成mutant的序列。
我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
东西会影响transcription。谢谢！
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s******s
发帖数: 13035 | 2 是不是也可能是degradation不一样。有啥药可以抑制一下的，处理看看？
20
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【在 K*C 的大作中提到】
: 做了个蛋白的mutant，换了200个bp左右，结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
: 倍。然后做了一下
: qPCR，发现是RNA的问题，RNA量下降了64倍。
: 然后我把这个mutant的200bp分成了3段，每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
: 蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type，把上面3段中其中一段突变
: 到mutant的序列，结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
: 成mutant的序列。
: 我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
: 东西会影响transcription。谢谢！
: ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
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K*C
发帖数: 2825 | 3 你是说protein degradation？应当不至于，当然还有一种解释是mutant的蛋白有毒性
，比如因为misfold或是什么原因。feedback regulation降低mRNA的量。
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【在 s******s 的大作中提到】
: 是不是也可能是degradation不一样。有啥药可以抑制一下的，处理看看？
:
: 20
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s******s
发帖数: 13035 | 4 RNA degradation
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【在 K*C 的大作中提到】
: 你是说protein degradation？应当不至于，当然还有一种解释是mutant的蛋白有毒性
: ，比如因为misfold或是什么原因。feedback regulation降低mRNA的量。
:
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K*C
发帖数: 2825 | 5 那主要应当是polyA问题吧，wt和mutant的poly A 应当没什么区别吧
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【在 s******s 的大作中提到】
: RNA degradation
:
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u******r
发帖数: 1541 | 6 你的序列GC含量有点高，可能会形成特殊二级结构影响转录
既然是mutant的序列，你可以自己改code换密码子
维持氨基酸序列不变的情况下，把GC/AT含量改的稳定一些，不要有些地方GC含量极高 |
