K*C 发帖数: 2825 | 1 做了个蛋白的mutant,换了200个bp左右,结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
倍。然后做了一下
qPCR,发现是RNA的问题,RNA量下降了64倍。
然后我把这个mutant的200bp分成了3段,每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type,把上面3段中其中一段突变
到mutant的序列,结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
成mutant的序列。
我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
东西会影响transcription。谢谢!
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s******s 发帖数: 13035 | 2 是不是也可能是degradation不一样。有啥药可以抑制一下的,处理看看?
20
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【在 K*C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做了个蛋白的mutant,换了200个bp左右,结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20 : 倍。然后做了一下 : qPCR,发现是RNA的问题,RNA量下降了64倍。 : 然后我把这个mutant的200bp分成了3段,每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果 : 蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type,把上面3段中其中一段突变 : 到mutant的序列,结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变 : 成mutant的序列。 : 我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的 : 东西会影响transcription。谢谢! : ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
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K*C 发帖数: 2825 | 3 你是说protein degradation?应当不至于,当然还有一种解释是mutant的蛋白有毒性
,比如因为misfold或是什么原因。feedback regulation降低mRNA的量。
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【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是不是也可能是degradation不一样。有啥药可以抑制一下的,处理看看? : : 20 : ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
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s******s 发帖数: 13035 | 4 RNA degradation
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【在 K*C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是说protein degradation?应当不至于,当然还有一种解释是mutant的蛋白有毒性 : ,比如因为misfold或是什么原因。feedback regulation降低mRNA的量。 : : ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
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K*C 发帖数: 2825 | 5 那主要应当是polyA问题吧,wt和mutant的poly A 应当没什么区别吧
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【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : RNA degradation : : ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
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u******r 发帖数: 1541 | 6 你的序列GC含量有点高,可能会形成特殊二级结构影响转录
既然是mutant的序列,你可以自己改code换密码子
维持氨基酸序列不变的情况下,把GC/AT含量改的稳定一些,不要有些地方GC含量极高 |