y********8
发帖数: 23 | 1 想把一条细菌的代谢途径在拟南芥中表达， 该途径共有12 个酶， 总共35kb， 问题是
如何把这些基因克隆进同一个载体，能不能用重组的方法，传统的restriction enzyme
似乎不大行。
谢谢！！！ |
c*********0
发帖数: 923 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 3 顶2楼的
我现在用Clontech的HD Fusion
挺好用的，不需要restriction enzyme
原理跟Gibson类似，不过一个是chew back 5'，一个是3'
另外35kb的话能不能放在两个质粒上？
enzyme
【在 y********8 的大作中提到】
: 想把一条细菌的代谢途径在拟南芥中表达， 该途径共有12 个酶， 总共35kb， 问题是
: 如何把这些基因克隆进同一个载体，能不能用重组的方法，传统的restriction enzyme
: 似乎不大行。
: 谢谢！！！
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X***n
发帖数: 366 | 4 如果这12基因在细菌基因组中是连在一起的，直接用recombineering拉下来就行，搜一
下pKD46就行。 |
s*****i
发帖数: 315 | 5 如果这些酶在同一个mRNA上，在拟南芥里面会不会只有第一个基因表达，其他的没法表
达啊。
楼主还要考虑怎么同时表达的问题。
enzyme
【在 y********8 的大作中提到】
: 想把一条细菌的代谢途径在拟南芥中表达， 该途径共有12 个酶， 总共35kb， 问题是
: 如何把这些基因克隆进同一个载体，能不能用重组的方法，传统的restriction enzyme
: 似乎不大行。
: 谢谢！！！
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f**u
发帖数: 346 | 6 promoter什么的都不对，直接放到植物里肯定不行。
把这个cluster改造成能在植物里面表达的版本可够你做的。
enzyme
【在 y********8 的大作中提到】
: 想把一条细菌的代谢途径在拟南芥中表达， 该途径共有12 个酶， 总共35kb， 问题是
: 如何把这些基因克隆进同一个载体，能不能用重组的方法，传统的restriction enzyme
: 似乎不大行。
: 谢谢！！！
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r******g
发帖数: 600 | 7 用recombination把那个片段弄下来不行吗？ |
q***7
发帖数: 144 | 8 估计你每一个基因的前面都要放一个启动子，建议最好放在不同的载体上，至少两个，
植物那一步可以进行双抗性筛选。
你们说的都是要PCR的，你如果能找到合适的酶切位点，建议还是用传统的方法。如果
３５K已经包括了所有的你需要的表达元件，建议用recommbineering。
用一下这个公司的PCR胶回收Kit，可以提高你克隆效率，而且便宜。具体请查看下面的
连接。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
good luck |
d****i
发帖数: 2346 | |
h**********r
发帖数: 671 | 10 要一个基因一个promoter一个terminator,可以考虑类似于biobrick的方法，或者其他
同尾酶。几个载体同时开工，最后放在两个或者更多，分布转化/整合到芥芥中去。 |
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b*********e
发帖数: 870 | 11 扑哧～～ ：D
纯回复这个“芥芥”，真是可爱的称呼～
【在 h**********r 的大作中提到】
: 要一个基因一个promoter一个terminator,可以考虑类似于biobrick的方法，或者其他
: 同尾酶。几个载体同时开工，最后放在两个或者更多，分布转化/整合到芥芥中去。
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g*********5
发帖数: 2533 | |
q*******8
发帖数: 768 | |
A******r
发帖数: 974 | 14 me 2
【在 q*******8 的大作中提到】
: 赞~~~学到好多~~~~
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s******y
发帖数: 17729 | 15 re
【在 f**u 的大作中提到】
: promoter什么的都不对，直接放到植物里肯定不行。
: 把这个cluster改造成能在植物里面表达的版本可够你做的。
:
: enzyme
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