r**a
发帖数: 121 | 1 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？ |
a********k
发帖数: 2273 | 2 yeast three hybrid
我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
r**a
发帖数: 121 | 3 这个可以在不知道结合什么RNA的情况下做？
【在 a********k 的大作中提到】
: yeast three hybrid
:
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
c*********r
发帖数: 1312 | 4 有好的抗体吗？
有的话能不能做CoIP，然后提取RNA做RNA-seq？
我的目标蛋白是localized，计划用类似的方法看这个complex里有没有localized RNA
。不知道是否可行。
【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
f*********9
发帖数: 258 | 5 用crispr／cas9
给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq |
q******g
发帖数: 3858 | 6 我觉得这个方法可行。即使没有好抗体，连个HA，也可以看看是否有RNA结合。
RNA
【在 c*********r 的大作中提到】
: 有好的抗体吗？
: 有的话能不能做CoIP，然后提取RNA做RNA-seq？
: 我的目标蛋白是localized，计划用类似的方法看这个complex里有没有localized RNA
: 。不知道是否可行。
|
g**********a
发帖数: 17 | 7 这个方法可行不 CLIP (Cross-Linking and Immunoprecipitation) Identification
of RNAs Bound by a Specific Protein） |
g********6
发帖数: 86 | 8 in vitro: 细菌表达GST融合蛋白，做GST pull down，可以用你提到的in vitro
transcribed rRNA，33P标记，完了之后做液闪。
in cell lines：转染HA/FLAG标记的蛋白表达质粒，做RNA immunoprecipitation，然
后做qPCR或RNA-seq。前面有人提到用CRISPR敲进标记，我觉得可能比较麻烦，不如用
质粒来的简单。当然最可信的方法还是用目的蛋白的抗体。 |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 9 能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白，然后把这个蛋白和你感兴趣的细
胞里分离纯化出来total RNA混合（注意buffer,pH），上Electrophoretic mobility
shift assay（EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。 |
r**a
发帖数: 121 | 10 谢谢各位的建议。
目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过，没有做出来。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白，然后把这个蛋白和你感兴趣的细
: 胞里分离纯化出来total RNA混合（注意buffer,pH），上Electrophoretic mobility
: shift assay（EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
: 白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。
|
|
|
c*********r
发帖数: 1312 | 11 不做RNA-seq也可以用抗体pull down，提RNA，测一下有没有RNA；如果有的话，可以进
一步反转录合成cDNA、dsDNA做个library，然后克隆测序吧。我想。
【在 r**a 的大作中提到】
: 谢谢各位的建议。
: 目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
: 我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
: 我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
: functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
: 不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
: 还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
: 所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
: 所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
: midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
|
r**a
发帖数: 121 | 12 如果这个方法可行，是最好的拉。
不过不好意思，对RNA，不适特别在行，
请问，这里怎么提取RNA，然后测RNA呢？
总不至于Nanodrop测浓度吧？
还有弄成cDNA之后，用随机引物合成dsDNA？
谢谢先了；－）
【在 c*********r 的大作中提到】
: 不做RNA-seq也可以用抗体pull down，提RNA，测一下有没有RNA；如果有的话，可以进
: 一步反转录合成cDNA、dsDNA做个library，然后克隆测序吧。我想。
|
c*********r
发帖数: 1312 | 13 我也不是内行。我觉得看你的input有多少。Input多的话，RNA怎么提都可以，用RNA
extraction kit，用trizol；RNA量大的话，用Nanodrop就可以检测吧。Input少的话，
可能需要比较小心，检测的话也需要用比较灵敏可靠的方法吧，这里我就不太了解了，
等版上其他高手解答吧。
Library构建的话有经典的方法吧，是不是最好用poly T primer + random primer来把
各种RNA都尽可能反转录？我没具体做过library，你再查查资料吧。我比较担心的是如
果rRNA比较多的话，最后挑克隆测序大部分都是rRNA。这样的话就最好不用random
primer了，或者通过其它方式deplete rRNA。其实rRNA多、input量大的话跑个RNA胶就
能检测RNA了。关键是你的蛋白可能会和哪些种类的RNA结合：rRNA, RNA with poly (A
) tail, RNA without poly (A) tail，甚至是小RNA。各种情况可能要分开讨论吧。
只是个人一点看法，仅供参考。
【在 r**a 的大作中提到】
: 如果这个方法可行，是最好的拉。
: 不过不好意思，对RNA，不适特别在行，
: 请问，这里怎么提取RNA，然后测RNA呢？
: 总不至于Nanodrop测浓度吧？
: 还有弄成cDNA之后，用随机引物合成dsDNA？
: 谢谢先了；－）
|
s******r
发帖数: 1245 | 14 clip肯定能pull到rna的，很多都是非特异，需要对比wt和rna binding domain
mutated两个样品间的区别，知道target的可以用realtime测，不知道target的只能上
array或者seq看
【在 r**a 的大作中提到】
: 如果这个方法可行，是最好的拉。
: 不过不好意思，对RNA，不适特别在行，
: 请问，这里怎么提取RNA，然后测RNA呢？
: 总不至于Nanodrop测浓度吧？
: 还有弄成cDNA之后，用随机引物合成dsDNA？
: 谢谢先了；－）
|
l**********1
发帖数: 5204 | 15 用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. Detailed protocols can be found in the Supplemental Information.
cited from
Cell. (2012).149:1393-406.
Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22658674
PDf link:
HTTP double dot//rnajc.ucsf.edu/sites/rnajc.ucsf.edu/files/
CastelloArticlePlusSupplementalJune2012.pdf
or
Nat Protoc. (2013). 8: 491-500.
System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23411631
more alternative methods such as
Proc Natl Acad Sci U S A. (2013). 110: 5416-21.
RNA-protein analysis using a conditional CRISPR nuclease.
pls check
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?linkname=pubmed_pubmed_cited
then S(earch)I(t)(by)Y(ourself)..
【在 r**a 的大作中提到】
: 谢谢各位的建议。
: 目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
: 我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
: 我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
: functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
: 不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
: 还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
: 所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
: 所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
: midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
|
j******n
发帖数: 941 | 16 RNA protection assay.
Crosslink, then RNase digest, then qPCR or other |
h******h
发帖数: 1257 | 17 如果是yeast的话可以试试用tagged U1A去pulldown对应的mRNA然后看看你的蛋白在不
在mRNA上面 |
r**a
发帖数: 121 | 18 谢谢大家的建议。
和老板讨论了一下，他建议简单的先来，
就IP拉下RNA，然后用random primer，看能不能弄下条带了
试试看吧，不知道行不行！
【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
b******k
发帖数: 1874 | 19
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~请问这个筛选是怎么做的呢？
我感觉RBP是一个比较难做的领域，可能是一个金矿。
【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
r**a
发帖数: 121 | 20 lotkaeuler11的回复里，好几个文章都是讲这个的
我就是主要看的其中的一个cell文章
【在 b******k 的大作中提到】
:
: ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~请问这个筛选是怎么做的呢？
: 我感觉RBP是一个比较难做的领域，可能是一个金矿。
|
|
|
a***e
发帖数: 1010 | 21 crosslink,
IP,
+/- RNaseA/T1
purify nucleic acid
p32 labeling,
PAGE |
v********a
发帖数: 646 | 22
good idea
【在 f*********9 的大作中提到】
: 用crispr／cas9
: 给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
: 或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq
|
a****n
发帖数: 3082 | 23 用小角中子散射可行
【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白，有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA，但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得，它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合，可能通过RNA方式
: 现在，我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢？
|
m***i
发帖数: 166 | 24 这个是最靠谱的。要跑SDS-PAGE，再转上nitrocellulose，然后曝光用phosphoimager
看。用高浓度RNase，这样如果看到的条带是和protein MW差不多就是了。negative
ctrl用IgG和没有UV x-link |
