n**********u 发帖数: 77 | 1 我最近用promega的Gotaq酶做pcr,然后再TA克隆。 情况是这样的:我循环是40,后面
有10min 72度extension.但是就是连接不上,pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
怀疑是我的TA kit的问题,但是也不是,因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
个当作template再来一次short-pcr后(15cycles,然后10min 72度extension)得到的
产物回收再做TA克隆,得到满板。这说明我的TA克隆是正确的,就是pcr的问题。 我怀
疑是开始的循环数太多了,就降到35个循环,但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
和体系出问题了,pcr的产物可能没有加上A尾,我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
行。我后来又做了加A尾的实验,换了fermentas一般taq酶,也还是不行。大家说可能
是什么原因。
我的pcr体系:
20ul体系
H2O 9
5*GoTaq color buffer 4
dNTP(2mM) 2
mgcl2(25mM) 1.6
BSA(100mg/ml) 0.15
primer-F(20uM) 1
primer-R(20uM) 1
template 1
taq 0.25
Sum 20
primer是degenerated primer所以浓度高一点
这是我的pcr产物的胶图:
http://www.kuaipan.cn/file/id_5701964222495829.htm?source=1 | m******u 发帖数: 12400 | 2 基因致死?我也碰到过。有些基因是因为DNA序列本身就可以造成细菌伤害而无需基因
产物,所以连不转录翻译的也不计较插入方向的TA克隆都不行。 | x********e 发帖数: 35261 | 3 一直用promega的gotaq做TA, 跟你不同的是我不加氯化镁和BSA,最多34个cycle。跑胶
确定条带单一后我直接用1ul PCR产物做连接
会不会你盐浓度太高了,或者产物和质粒的比例不对
【在 n**********u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近用promega的Gotaq酶做pcr,然后再TA克隆。 情况是这样的:我循环是40,后面 : 有10min 72度extension.但是就是连接不上,pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我 : 怀疑是我的TA kit的问题,但是也不是,因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几 : 个当作template再来一次short-pcr后(15cycles,然后10min 72度extension)得到的 : 产物回收再做TA克隆,得到满板。这说明我的TA克隆是正确的,就是pcr的问题。 我怀 : 疑是开始的循环数太多了,就降到35个循环,但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶 : 和体系出问题了,pcr的产物可能没有加上A尾,我加大酶量和dntp的量。 但是还是不 : 行。我后来又做了加A尾的实验,换了fermentas一般taq酶,也还是不行。大家说可能 : 是什么原因。 : 我的pcr体系:
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