s******y
发帖数: 28562 | 1 我们本来是想做一个可诱导表达的蛋白载体，在同事们中问了一圈，只有一个人有一个
tetracyclin-inducible vector for shRNA (Tet-On pLKO) ,而且promoter 是H1。 我
想问的是，假如
我用这个来表达一个很小的蛋白（10kd)行不行？ |
w*********3
发帖数: 217 | 2 不行。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.0.1
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们本来是想做一个可诱导表达的蛋白载体，在同事们中问了一圈，只有一个人有一个
: tetracyclin-inducible vector for shRNA (Tet-On pLKO) ,而且promoter 是H1。 我
: 想问的是，假如
: 我用这个来表达一个很小的蛋白（10kd)行不行？
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s******y
发帖数: 28562 | 3 哦。。。能不能说说为什么呢？
【在 w*********3 的大作中提到】
: 不行。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.0.1
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j****x
发帖数: 1704 | 4 没polyA呗
【在 s******y 的大作中提到】
: 哦。。。能不能说说为什么呢？
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s******y
发帖数: 28562 | 5 PolyA 以及ribosome binding site我们可以自己加啊。
我比较担心的是RNA pol III 是不是不能转录比较长的RNA? 或者转录出来的头部结构
不对所以核糖体结合不上去？
【在 j****x 的大作中提到】
: 没polyA呗
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a*******a
发帖数: 4233 | 6 只知道polIII不能太长，最多一百多个碱基
【在 s******y 的大作中提到】
: PolyA 以及ribosome binding site我们可以自己加啊。
: 我比较担心的是RNA pol III 是不是不能转录比较长的RNA? 或者转录出来的头部结构
: 不对所以核糖体结合不上去？
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j****x
发帖数: 1704 | 7 首先你需要5'的mG cap，这个是核糖体结合的识别信号对吧？U6/H1都没戏。当然你可
以搞个IRES，但是效率是个问题。polyA自己加？这个不现实吧，合并IRES，基本上就
超过POL III的理想转录本长度范围了，何必冒险呢，既然要做表达载体，这么折腾没
任何意义啊，你要的这类载体满天飞，不行几百块买一个或者直接序列合成了
【在 s******y 的大作中提到】
: PolyA 以及ribosome binding site我们可以自己加啊。
: 我比较担心的是RNA pol III 是不是不能转录比较长的RNA? 或者转录出来的头部结构
: 不对所以核糖体结合不上去？
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s******y
发帖数: 28562 | 8 哦， 那就不行了。
【在 a*******a 的大作中提到】
: 只知道polIII不能太长，最多一百多个碱基
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X******n
发帖数: 914 | 9 Addgene $65一个，买一个吧。我有的全是gateway的，你又不喜欢 ：）
【在 s******y 的大作中提到】
: 哦， 那就不行了。
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s******y
发帖数: 28562 | 10 我们在Addgene翻了半天了，看到的可诱导系统都是需要两个vector 的，就是需要把那
个repressor 放在另外一个vector 上的。但是我们的细胞因为转了其他东西已经用掉
了两个marker 了(Neo/Kan 和GFP），所以希望弄一个单vector的系统。
另外，我的博士后们不肯用gateway。他们貌似对没有用过的东西都有戒心。我怎么说
都不行。麻烦啊。
【在 X******n 的大作中提到】
: Addgene $65一个，买一个吧。我有的全是gateway的，你又不喜欢 ：）
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X******n
发帖数: 914 | 11 我的这些就在一个vector上。
哈哈，让他们把一个基因放到10个不同的vector里面，他们就知道了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们在Addgene翻了半天了，看到的可诱导系统都是需要两个vector 的，就是需要把那
: 个repressor 放在另外一个vector 上的。但是我们的细胞因为转了其他东西已经用掉
: 了两个marker 了(Neo/Kan 和GFP），所以希望弄一个单vector的系统。
: 另外，我的博士后们不肯用gateway。他们貌似对没有用过的东西都有戒心。我怎么说
: 都不行。麻烦啊。
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X******n
发帖数: 914 | |
s******y
发帖数: 28562 | 13 谢谢！！！这个好像也是gateway cloning吧？应该不需要关心酶切点吧？
【在 X******n 的大作中提到】
: https://www.addgene.org/41394/
: 这个能找到合适的酶切位点不？
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X******n
发帖数: 914 | 14 你也可以用酶切的，如果不喜gateway的话。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！！！这个好像也是gateway cloning吧？应该不需要关心酶切点吧？
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a****d
发帖数: 1919 | 15 H1和U6 promotor 都不能用来过表达蛋白。
FUW TetO是常用的dox inducible overexpression lentivector.这个载体有多个酶切
位点，方便subcloning。我建议sunny老师找Stanford的Wernig lab要一下。 |
X******n
发帖数: 914 | 16 这个Addgene也有吧，我有一个就是这个改造的。
【在 a****d 的大作中提到】
: H1和U6 promotor 都不能用来过表达蛋白。
: FUW TetO是常用的dox inducible overexpression lentivector.这个载体有多个酶切
: 位点，方便subcloning。我建议sunny老师找Stanford的Wernig lab要一下。
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a****d
发帖数: 1919 | 17 有deposit就再方便不过了
【在 X******n 的大作中提到】
: 这个Addgene也有吧，我有一个就是这个改造的。
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X******n
发帖数: 914 | |
s******y
发帖数: 28562 | 19 我看看我能不能狠一点逼他们用这个gateway system. 他们现在都在得过且过的用传统
的酶切法。我看他们主要是怕麻烦而且懒得去学新技术。
【在 X******n 的大作中提到】
: 你也可以用酶切的，如果不喜gateway的话。
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s******r
发帖数: 1245 | 20 内切酶比重组酶便宜
【在 s******y 的大作中提到】
: 我看看我能不能狠一点逼他们用这个gateway system. 他们现在都在得过且过的用传统
: 的酶切法。我看他们主要是怕麻烦而且懒得去学新技术。
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a*******a
发帖数: 4233 | 21 gibson呢？
我们实验室三个人花了两个月用gateway做了四千个表达质粒并且验证了表达，还是很
好用的。。
我现在不用gateway/gibson主要是贵， 有人出钱还不用真是。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我看看我能不能狠一点逼他们用这个gateway system. 他们现在都在得过且过的用传统
: 的酶切法。我看他们主要是怕麻烦而且懒得去学新技术。
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s******y
发帖数: 28562 | 22 哦。。。贵很多么？我其实还没有亲自用过不知道有多贵
（大家别鄙视我。。。－－)
但是如果用酶切法的话在不同vector之间倒腾比较麻烦吧?
【在 s******r 的大作中提到】
: 内切酶比重组酶便宜
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X******n
发帖数: 914 | 23 如果只做一个基因，确实是。如果经常把一个基因放到不同的载体里面，其实gateway
更便宜。
不要follow invitrogen的protocol，这个酶效率很高，可以降低到1／4
【在 s******r 的大作中提到】
: 内切酶比重组酶便宜
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X******n
发帖数: 914 | 24 你们自己做的PCR，还是买的entry clone？
很
【在 a*******a 的大作中提到】
: gibson呢？
: 我们实验室三个人花了两个月用gateway做了四千个表达质粒并且验证了表达，还是很
: 好用的。。
: 我现在不用gateway/gibson主要是贵， 有人出钱还不用真是。。。
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a*******a
发帖数: 4233 | 25 买的entry
自己做pcr就是神了。。。
【在 X******n 的大作中提到】
: 你们自己做的PCR，还是买的entry clone？
:
: 很
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a*******a
发帖数: 4233 | 26 好像以前算过一个反应大概20-30刀吧，用这个是否划算主要看看系统稳定否。
我读博时候实验室所有的载体酶切位点顺序都是一样的，简单的换个载体什么的切了一
连也就是几RMB钱半天的labor，国内的博士生你懂的。
博后的话一天$100，克隆不稳定的实验室花一个星期去搞伐搞伐搞不出来就头疼了。
你那一周在实验室出现60小时就是勤快人了吧。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 哦。。。贵很多么？我其实还没有亲自用过不知道有多贵
: （大家别鄙视我。。。－－)
: 但是如果用酶切法的话在不同vector之间倒腾比较麻烦吧?
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g*********5
发帖数: 2533 | 27 hi, Bro, you are boss!
【在 s******y 的大作中提到】
: 我看看我能不能狠一点逼他们用这个gateway system. 他们现在都在得过且过的用传统
: 的酶切法。我看他们主要是怕麻烦而且懒得去学新技术。
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s******y
发帖数: 28562 | 28 刚才跑到实验室去和他们说了，然后勉强同意了，然后仔细一查我们的库存，发现我们
没有Gateway entry vector... 悲剧了。。。
【在 g*********5 的大作中提到】
: hi, Bro, you are boss!
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X******n
发帖数: 914 | |
s*****i
发帖数: 315 | 30 找一个lenti的backbone, 把原来的MCS位点替换成 TRE-MCS-CMV-rtTA 就可以了。一劳
永逸。
【在 s******y 的大作中提到】
: 刚才跑到实验室去和他们说了，然后勉强同意了，然后仔细一查我们的库存，发现我们
: 没有Gateway entry vector... 悲剧了。。。
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p*********n
发帖数: 556 | 31 gateway超好用的啊!
【在 s******y 的大作中提到】
: 我看看我能不能狠一点逼他们用这个gateway system. 他们现在都在得过且过的用传统
: 的酶切法。我看他们主要是怕麻烦而且懒得去学新技术。
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s******s
发帖数: 13035 | 32 原来实验室做了几十种promoter，几十种各式tag或者T2A
puro一类的，要表达啥，随便找个tag，promoter，然后去
网上或者facility的library里面挖个基因clone出来，一个礼拜
就搞定，两个礼拜细胞转染好，异常方便。
坏处是，gateway那个酶巨烂，绝对用不到十次。除非
每次做多个克隆，否则用过五六次就失活了，极端怀疑
life里面有猫腻，比如偷偷加了低浓度的蛋白酶一类
很
【在 a*******a 的大作中提到】
: gibson呢？
: 我们实验室三个人花了两个月用gateway做了四千个表达质粒并且验证了表达，还是很
: 好用的。。
: 我现在不用gateway/gibson主要是贵， 有人出钱还不用真是。。。
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s******s
发帖数: 13035 | 33 entry不用买，网上无数library, 大多数不到100，省时省力。
我们学校facility以前做蛋白表达，自己都有全套的，全免费。
我看如果学校比较大，搞这么一套太方便了。
【在 X******n 的大作中提到】
: 你们自己做的PCR，还是买的entry clone？
:
: 很
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X******n
发帖数: 914 | 34 哪个公司有这么便宜的entry clone，能不能推荐一家？特别是一些比较长的基因如果
能在100块一下买来，那真可以省我不少时间？我通常都是自己PCR。
【在 s******s 的大作中提到】
: entry不用买，网上无数library, 大多数不到100，省时省力。
: 我们学校facility以前做蛋白表达，自己都有全套的，全免费。
: 我看如果学校比较大，搞这么一套太方便了。
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s******s
发帖数: 13035 | 35 不是公司的，是哪个学校或者研究所的，好像90一个，刚才翻了一下找不到bookmark了。
其实做的多，应该合起来买个ORFeomes的library，多爽啊
【在 X******n 的大作中提到】
: 哪个公司有这么便宜的entry clone，能不能推荐一家？特别是一些比较长的基因如果
: 能在100块一下买来，那真可以省我不少时间？我通常都是自己PCR。
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s******y
发帖数: 28562 | 36 哦，在哪里看到的？记起来之后跟我们分享一下吧！
了。
【在 s******s 的大作中提到】
: 不是公司的，是哪个学校或者研究所的，好像90一个，刚才翻了一下找不到bookmark了。
: 其实做的多，应该合起来买个ORFeomes的library，多爽啊
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s******s
发帖数: 13035 | 37 找到一个，$43一个clone，1600一个plate，够一般实验室用一阵子了
https://dnasu.org/DNASU/CloneCost.jsp
【在 s******y 的大作中提到】
: 哦，在哪里看到的？记起来之后跟我们分享一下吧！
:
: 了。
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z********8
发帖数: 818 | 38
Good
【在 s******s 的大作中提到】
: 找到一个，$43一个clone，1600一个plate，够一般实验室用一阵子了
: https://dnasu.org/DNASU/CloneCost.jsp
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s******s
发帖数: 13035 | 39 话说这个省时省力，雇一个postdoc哼哧哼哧做一个礼拜，测序
说不定还是错的，不说人工，就是材料费也不值。一直想不通有
的PI就是不喜欢买，老想着去讨或者自己做
【在 z********8 的大作中提到】
:
: Good
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X******n
发帖数: 914 | 40 谢谢！
这个真是太便宜了。可惜我想要的几个基因没有。
提醒一下：Human Orfome 8.1里面大概有20％的基因不是全长或者是小的isoform。
再问个问题：如果有pLX304 lentivrial expression collection（大概13000个基因）
，你会用它来干什么呢？
【在 s******s 的大作中提到】
: 找到一个，$43一个clone，1600一个plate，够一般实验室用一阵子了
: https://dnasu.org/DNASU/CloneCost.jsp
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