y*****u
发帖数: 31 | 1 近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质
量很差。第二次改进了方法测出浓度较高，质量很差，然后用NACL和酒精简单洗了后浓
度低极了，质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法，但是由于方法说明
比较模糊，所以试着做了下，DNA浓度低，质量差。
这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后，在有机层中加入1/10体积的
10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层（上清，
中间一层白色物质，下层的粉色物质）。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清，
所以我就抽取上清加入95%冷酒精，-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗，结果没有看到DNA白色沉淀，
测试后发现DNA质量差，浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
间一层白色物质（一开始以为上清是DNA),结果发现DNA浓度很高，质量也行。我怀疑
DNA根本就不在上清里面，而是在中间一层的白色物质内（这边有个疑问点就是这个白
色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面，所以这些chemicals对NANO DROP影响
有多大，是否我测出的读数根本不就不是DNA).
我现在有个选择：
我已经保留了那个移去上清的管（内有中层白色物质和下层粉红物质）。我打算照着
TRIZOL原始的PROTOCOL用100%酒精沉淀DNA(如果那层白色物质真的是DNA的话），然后
用柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗DNA.
现在的疑问是：
1. 那个中间层白色物质是否是DNA
2. 白色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面,我用100%酒精是否能沉淀出DNA
3. 原始PROTOCOL要求轻柔混匀，用2,000g为DNA沉淀清洗。我改为12,000g后效果很好
。现在我看了一个PROTOCOL(VU MEDISCH CENTRUM)DNA提取过程直接用VORTEX剧烈震荡
混匀，加速到20,000g.请问这样效果会好吗，DNA震成这样不散架了么？
4.我后续是做测序。
请各位大神赐教，小女子不胜感激。比较啰嗦。但是真的很苦恼，因为标本珍贵，是在
不容许一试再试。 |
t******k
发帖数: 5617 | |
y*****u
发帖数: 31 | 3 因为要从同一组织同时提RNA和DNA.而且组织运来时已经在TRIZOL里面了。 |
j*****9
发帖数: 716 | 4 用 Qiagen的 AllPrep DNA/RNA/Protein kit，DNA和RNA非常好，个人经验蛋白倒是很
差。 |
y*****u
发帖数: 31 | 5 现在所有的样品都已经在TRIZOL里面寄来的。无法使用Qiagen家的KIT了，是否有生化
方面的专家能帮我分析一下我目前打算采取的步骤是否合理呢？ |
a***e
发帖数: 1010 | 6 TRIzol
上层: RNA 或者质粒DNA
中层: gDNA
下层: protein |
c********b
发帖数: 363 | 7 只是觉得可行，但是没有试过，你可以考虑下。
在你的trizol：chloroform分离移去了RNA上清后，应该接着加碱性的Phenol（和剩余
提及1:1），然后再离心取上清，加酒精，然后不要用沉淀法而是用一个提gDNA的柱子
过柱，清洗，回收。
good luck
【在 y*****u 的大作中提到】
: 近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质
: 量很差。第二次改进了方法测出浓度较高，质量很差，然后用NACL和酒精简单洗了后浓
: 度低极了，质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法，但是由于方法说明
: 比较模糊，所以试着做了下，DNA浓度低，质量差。
: 这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后，在有机层中加入1/10体积的
: 10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层（上清，
: 中间一层白色物质，下层的粉色物质）。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清，
: 所以我就抽取上清加入95%冷酒精，-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
: TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗，结果没有看到DNA白色沉淀，
: 测试后发现DNA质量差，浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
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Z******5
发帖数: 435 | 8 曾经尝试用Trizol同时分离过cell line的RNA和蛋白质，感觉根本不靠谱。 后来还是
平行做两盘，一盘只提RNA，一盘做蛋白，方便快捷又保险。 |
h*******o
发帖数: 4884 | 9 trizol做RNA和DNA还行，protein那个做出来，不加SDS根本没法溶，加了SDS 跑出来的
胶跟鬼画符一样
DNA 我以前用trizol做没什么问题
就是干的时候不能太久，如果容不了可以加NaOH 去溶 |
