y*****u 发帖数: 31 | 1 近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质
量很差。第二次改进了方法测出浓度较高,质量很差,然后用NACL和酒精简单洗了后浓
度低极了,质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法,但是由于方法说明
比较模糊,所以试着做了下,DNA浓度低,质量差。
这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后,在有机层中加入1/10体积的
10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层(上清,
中间一层白色物质,下层的粉色物质)。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清,
所以我就抽取上清加入95%冷酒精,-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗,结果没有看到DNA白色沉淀,
测试后发现DNA质量差,浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
间一层白色物质(一开始以为上清是DNA),结果发现DNA浓度很高,质量也行。我怀疑
DNA根本就不在上清里面,而是在中间一层的白色物质内(这边有个疑问点就是这个白
色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面,所以这些chemicals对NANO DROP影响
有多大,是否我测出的读数根本不就不是DNA).
我现在有个选择:
我已经保留了那个移去上清的管(内有中层白色物质和下层粉红物质)。我打算照着
TRIZOL原始的PROTOCOL用100%酒精沉淀DNA(如果那层白色物质真的是DNA的话),然后
用柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗DNA.
现在的疑问是:
1. 那个中间层白色物质是否是DNA
2. 白色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面,我用100%酒精是否能沉淀出DNA
3. 原始PROTOCOL要求轻柔混匀,用2,000g为DNA沉淀清洗。我改为12,000g后效果很好
。现在我看了一个PROTOCOL(VU MEDISCH CENTRUM)DNA提取过程直接用VORTEX剧烈震荡
混匀,加速到20,000g.请问这样效果会好吗,DNA震成这样不散架了么?
4.我后续是做测序。
请各位大神赐教,小女子不胜感激。比较啰嗦。但是真的很苦恼,因为标本珍贵,是在
不容许一试再试。 |
t******k 发帖数: 5617 | |
y*****u 发帖数: 31 | 3 因为要从同一组织同时提RNA和DNA.而且组织运来时已经在TRIZOL里面了。 |
j*****9 发帖数: 716 | 4 用 Qiagen的 AllPrep DNA/RNA/Protein kit,DNA和RNA非常好,个人经验蛋白倒是很
差。 |
y*****u 发帖数: 31 | 5 现在所有的样品都已经在TRIZOL里面寄来的。无法使用Qiagen家的KIT了,是否有生化
方面的专家能帮我分析一下我目前打算采取的步骤是否合理呢? |
a***e 发帖数: 1010 | 6 TRIzol
上层: RNA 或者质粒DNA
中层: gDNA
下层: protein |
c********b 发帖数: 363 | 7 只是觉得可行,但是没有试过,你可以考虑下。
在你的trizol:chloroform分离移去了RNA上清后,应该接着加碱性的Phenol(和剩余
提及1:1),然后再离心取上清,加酒精,然后不要用沉淀法而是用一个提gDNA的柱子
过柱,清洗,回收。
good luck
【在 y*****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质 : 量很差。第二次改进了方法测出浓度较高,质量很差,然后用NACL和酒精简单洗了后浓 : 度低极了,质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法,但是由于方法说明 : 比较模糊,所以试着做了下,DNA浓度低,质量差。 : 这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后,在有机层中加入1/10体积的 : 10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层(上清, : 中间一层白色物质,下层的粉色物质)。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清, : 所以我就抽取上清加入95%冷酒精,-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的 : TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗,结果没有看到DNA白色沉淀, : 测试后发现DNA质量差,浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
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Z******5 发帖数: 435 | 8 曾经尝试用Trizol同时分离过cell line的RNA和蛋白质,感觉根本不靠谱。 后来还是
平行做两盘,一盘只提RNA,一盘做蛋白,方便快捷又保险。 |
h*******o 发帖数: 4884 | 9 trizol做RNA和DNA还行,protein那个做出来,不加SDS根本没法溶,加了SDS 跑出来的
胶跟鬼画符一样
DNA 我以前用trizol做没什么问题
就是干的时候不能太久,如果容不了可以加NaOH 去溶 |