r******k 发帖数: 446 | 1 我构建的质粒HA-NLS (nuclear localization sequence)- gene- flag。
好像表达了一个HA-NLS-gene-flag。 又表达了一个 gene-flag。 怎么办? 把我要的
基因的atg pcr掉?重新做质粒?thank you!!!! |
T****u 发帖数: 424 | 2 mutagenesis掉
【在 r******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我构建的质粒HA-NLS (nuclear localization sequence)- gene- flag。 : 好像表达了一个HA-NLS-gene-flag。 又表达了一个 gene-flag。 怎么办? 把我要的 : 基因的atg pcr掉?重新做质粒?thank you!!!!
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q***7 发帖数: 144 | 3 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手
常犯的错误就是保留基因自身的ATG,有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白
表达。
另外一个应该特别注意的就是Stop Codon,在原核中表达就要用原核的常用的Stop
Codon,真核表达就用真核的,而且至少加两个,两个常用的,或一个常用,一个次常
用的。
做突变很可能在其他地方引入其他突变,如果用kit价格上很贵,不如重新做。
做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit.
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation- |
j****x 发帖数: 1704 | 4 保留gene自身的ATG也能叫错误?
BTW,无论真核原核,mRNA天然的stop codon,有多大比例是有两个的?谢谢
【在 q***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手 : 常犯的错误就是保留基因自身的ATG,有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白 : 表达。 : 另外一个应该特别注意的就是Stop Codon,在原核中表达就要用原核的常用的Stop : Codon,真核表达就用真核的,而且至少加两个,两个常用的,或一个常用,一个次常 : 用的。 : 做突变很可能在其他地方引入其他突变,如果用kit价格上很贵,不如重新做。 : 做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit. : http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification : http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation-
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q***7 发帖数: 144 | 5 如果你是做蛋白表达纯化出身的,你就知道做融合蛋白时,一般都会把后面那个基因
ATG去掉。你可以不叫他错误,但是有时候你回得到多个表达蛋白。
关于Stop codon,你可以在GOOGLE里搜索一下,真核生物(例如人)和原核生物(如E.
coli)的密码子使用频率表,你会发现他们对终止密码子,不是只用一个,而是机率不
同。只放一个终止密码子有时会造成通读,你蛋白表达纯化是有时看到比你预测的大的
蛋白有时就是通读造成的。
有什么问题欢迎提问,谢谢
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 保留gene自身的ATG也能叫错误? : BTW,无论真核原核,mRNA天然的stop codon,有多大比例是有两个的?谢谢
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j****x 发帖数: 1704 | 6 你知道一个蛋白编码序列中中,有多少个ATG吗?又有多少个可以作为start codon的
ATG吗?
第二个问题,我觉得所答非所问,或者我没理解你的意思。我重复一遍我的问题,天然
mRNA有多少使用连续两个stop codon的,又有多少出现过通读。谢谢。
E.
【在 q***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果你是做蛋白表达纯化出身的,你就知道做融合蛋白时,一般都会把后面那个基因 : ATG去掉。你可以不叫他错误,但是有时候你回得到多个表达蛋白。 : 关于Stop codon,你可以在GOOGLE里搜索一下,真核生物(例如人)和原核生物(如E. : coli)的密码子使用频率表,你会发现他们对终止密码子,不是只用一个,而是机率不 : 同。只放一个终止密码子有时会造成通读,你蛋白表达纯化是有时看到比你预测的大的 : 蛋白有时就是通读造成的。 : 有什么问题欢迎提问,谢谢
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s********x 发帖数: 472 | 7 大部分时候确实没必要去掉atg,但是偶尔会有内部initiation的时候。
很对时候可能是设计的atg附近序列缺乏足够强的ribosome识别,或者碰巧蛋白中段有
类似ires的序列。
如果出现突变掉atg就好了。
至于stop codon,一个确实有一定的读传概率,如果是舜转大量的dna,往往回detect
读穿。但是如果是knock in 一两个copy,一般检测不到读穿,当然总会有微量的。每
次都加多个stop有点强迫,不过确实可能有帮助,只不过大多数没用。 |
q***7 发帖数: 144 | 8 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦?至于一个基因内部的ATG有没有可能
ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译,你可以放狗狗里搜一下,这个我没有时
间来回答
另外,一个基因在其自然情况大都是一个,这个搞大规模预测的都有这方面文章发表,
有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达,离开了其自然选择的
前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子,为了保险做好加入要表达宿主
最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密
码子后通读就消失了。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你知道一个蛋白编码序列中中,有多少个ATG吗?又有多少个可以作为start codon的 : ATG吗? : 第二个问题,我觉得所答非所问,或者我没理解你的意思。我重复一遍我的问题,天然 : mRNA有多少使用连续两个stop codon的,又有多少出现过通读。谢谢。 : : E.
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j****x 发帖数: 1704 | 9 很明显,关于这两个问题前面一个回帖要有营养的多,而不是用一个什么“初学者的常
见错误”来摆谱。
其实我很清楚这两个问题的答案是什么,远不是某些人理解的那么单一。我当初开始做
表达纯化的时候,导师就告诉我要知其然还要知其所以然。不过我也知道身边不少只做
某一专门方向或领域的人容易教条或者说,容易固执,把某些tips当成是金科玉律雷打
不动,不过这也可以理解。
【在 q***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦?至于一个基因内部的ATG有没有可能 : ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译,你可以放狗狗里搜一下,这个我没有时 : 间来回答 : 另外,一个基因在其自然情况大都是一个,这个搞大规模预测的都有这方面文章发表, : 有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达,离开了其自然选择的 : 前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子,为了保险做好加入要表达宿主 : 最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密 : 码子后通读就消失了。
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l******a 发帖数: 3339 | 10 说实话,你太不虚心了,我就是一个路过打酱油的。但是我觉得3楼说的很对。在楼主
的这个case中,他做的是fusion protein,前面放了signal peptide,应该去掉
methione,防止alternative translation,后面加两个stop codon也是常做的。我不
觉得这是tip,这就是常识。3楼拿出来给大家分享是好的,反倒觉得你想是在说教。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 很明显,关于这两个问题前面一个回帖要有营养的多,而不是用一个什么“初学者的常 : 见错误”来摆谱。 : 其实我很清楚这两个问题的答案是什么,远不是某些人理解的那么单一。我当初开始做 : 表达纯化的时候,导师就告诉我要知其然还要知其所以然。不过我也知道身边不少只做 : 某一专门方向或领域的人容易教条或者说,容易固执,把某些tips当成是金科玉律雷打 : 不动,不过这也可以理解。
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r******k 发帖数: 446 | 11 Yes i have an ires system!
【在 q***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦?至于一个基因内部的ATG有没有可能 : ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译,你可以放狗狗里搜一下,这个我没有时 : 间来回答 : 另外,一个基因在其自然情况大都是一个,这个搞大规模预测的都有这方面文章发表, : 有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达,离开了其自然选择的 : 前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子,为了保险做好加入要表达宿主 : 最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密 : 码子后通读就消失了。
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j****x 发帖数: 1704 | 12 说实话,这里能有什么可说教的?三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误,我不认同而已。融合蛋白表达载体,无论商用还是文献中报道的,保留后
面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢?实践中如果
确认出现了alternative translation,需要“检讨”的,首先应该是载体/序列设计:
前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus;转录起始位点到翻译
起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构;序列中是否有IRES,位置是
不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
就非得突变下游ATG,因为如果前面的根源不解决,就算去除了后面ORF的起始ATG,整
个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始,所谓治标不
治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon,我在需要的时候也这么做过
,但不会简单的把这种做法当成“金科玉律”,会分情况选择使用,当做tip推荐给别
人的时候也会解释原因,而不是以一句“这就是常识”敷衍,至少考虑一下听者的感受
。这是我和三楼争辩的本意,如果让人觉得我不虚心,那我反思一下。
【在 l******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说实话,你太不虚心了,我就是一个路过打酱油的。但是我觉得3楼说的很对。在楼主 : 的这个case中,他做的是fusion protein,前面放了signal peptide,应该去掉 : methione,防止alternative translation,后面加两个stop codon也是常做的。我不 : 觉得这是tip,这就是常识。3楼拿出来给大家分享是好的,反倒觉得你想是在说教。
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m******5 发帖数: 1383 | 13 同意!!
另外有一点,我觉得很多人都觉得上下两条带是alternative translation,其实很可
能是其它Sumo或者Ubiquitin或者磷酸化修饰导致的。alternative translation的可能
性我认为不大。
另一种更常见的情况是下面那条带其实是N-termianl truncation band.
我认为这几种情况都比alternative translation可能性大得多。
在楼主的case里,甚至有可能上下两条带都是Full-Length,只不过Flag antibody
affinity比HA antibody高很多,导致楼主误以为下面没有HA tag.
很多蛋白都有multiple in frame的ATG,通常后面的ATG是不会起作用的(除非有
alternative splicing或者复杂的RNA secondary structure.)
退一万步说,除了in frame的ATG,还有很多非in frame的ATG,设想一下,如果这些ATG
能起作用,细胞早就被junk protein淹没了(当然,非in frame产物如果不在最后的
exon终止会被NMD去掉)
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说实话,这里能有什么可说教的?三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一 : 个初级错误,我不认同而已。融合蛋白表达载体,无论商用还是文献中报道的,保留后 : 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢?实践中如果 : 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的,首先应该是载体/序列设计: : 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus;转录起始位点到翻译 : 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构;序列中是否有IRES,位置是 : 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必 : 就非得突变下游ATG,因为如果前面的根源不解决,就算去除了后面ORF的起始ATG,整 : 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始,所谓治标不 : 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon,我在需要的时候也这么做过
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l******a 发帖数: 3339 | 14 Most fusion case, it does not matter. You want to keep the methionine, keep
it, it wont do a damn thing. But here is a short signal peptide fusion, so I
say remove the methionine. clear?
I dont know what "初级错误" he was talking about. I am just saying, what he
said make sense to me, and I would do the exact same thing for this case,
period.
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说实话,这里能有什么可说教的?三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一 : 个初级错误,我不认同而已。融合蛋白表达载体,无论商用还是文献中报道的,保留后 : 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢?实践中如果 : 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的,首先应该是载体/序列设计: : 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus;转录起始位点到翻译 : 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构;序列中是否有IRES,位置是 : 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必 : 就非得突变下游ATG,因为如果前面的根源不解决,就算去除了后面ORF的起始ATG,整 : 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始,所谓治标不 : 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon,我在需要的时候也这么做过
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l******a 发帖数: 3339 | 15 see my reply above.
【在 m******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 同意!! : 另外有一点,我觉得很多人都觉得上下两条带是alternative translation,其实很可 : 能是其它Sumo或者Ubiquitin或者磷酸化修饰导致的。alternative translation的可能 : 性我认为不大。 : 另一种更常见的情况是下面那条带其实是N-termianl truncation band. : 我认为这几种情况都比alternative translation可能性大得多。 : 在楼主的case里,甚至有可能上下两条带都是Full-Length,只不过Flag antibody : affinity比HA antibody高很多,导致楼主误以为下面没有HA tag. : 很多蛋白都有multiple in frame的ATG,通常后面的ATG是不会起作用的(除非有 : alternative splicing或者复杂的RNA secondary structure.)
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s*********y 发帖数: 292 | 16 问下,一个蛋白如果有好多个Met,每个ATG都有可能开始翻译吗? |
c**********r 发帖数: 138 | 17 情商太低.
说实话,这里能有什么可说教的?三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误,我不认同而已。融合蛋白表达载体,无论商用还是文献中报道的,保留后
面ORF里ATG的........
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说实话,这里能有什么可说教的?三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一 : 个初级错误,我不认同而已。融合蛋白表达载体,无论商用还是文献中报道的,保留后 : 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢?实践中如果 : 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的,首先应该是载体/序列设计: : 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus;转录起始位点到翻译 : 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构;序列中是否有IRES,位置是 : 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必 : 就非得突变下游ATG,因为如果前面的根源不解决,就算去除了后面ORF的起始ATG,整 : 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始,所谓治标不 : 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon,我在需要的时候也这么做过
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j****x 发帖数: 1704 | 18 我觉得我前面的帖子已经解释的很清楚了...好吧,即便是这个case里的N-terminal HA
Tag(-NLS)的表达载体,能查到的商用的或是自建的有很多都不去除后面那个Met,
我手头几种载体的manual中也没有特殊说明需要专门去除,只是强调in frame
insertion。
所以,套用你的话,这个Met你愿意删掉就删掉,nobody cares。而这种tip到底算不算
你所谓的“常识”,反正也没个标准,大可不必争了。如果你手边有哪个商用载体明确
指出推荐去除后面的Met,请分享,谢谢。我想说的是,三楼把没有去除Met这一点当成
是LZ出现问题的解释和解决方法,我觉得值得商榷,真正问题根源所在很可能并不在此
,原因我和LZ一位朋友已经解释了,如果你不同意,可以继续讨论。如果你不知道三楼
所说的“初级错误”是指什么,那么关于这一点我们这里也没什么好纠缠的了。
keep
I
he
【在 l******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Most fusion case, it does not matter. You want to keep the methionine, keep : it, it wont do a damn thing. But here is a short signal peptide fusion, so I : say remove the methionine. clear? : I dont know what "初级错误" he was talking about. I am just saying, what he : said make sense to me, and I would do the exact same thing for this case, : period.
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j****x 发帖数: 1704 | 19 以下来自教科书的经典理论(个人理解,欢迎纠错):
原核mRNA,SD序列之后的第一个ATG,就是起始ATG,其他的都歇菜(多顺反子每个单算
)。
真核mRNA,mG7 cap后第一个“适宜”的ATG为起始ATG。至于怎么定义“适宜”,目前
还没完全彻底的搞清楚,但ATG所处的sequence context是关键因素这一点是很明确的
,统计上讲就是所谓的kozak consensus((gcc)gccAccAUGG)。既然是统计规律,自然
就有大量的反例,所以过往在做genome/mRNA annotation的时候有很多预测出来的CDS
是错误的,或者不完整,5'端有遗漏,这个问题至今在bioinformatics界也没有被彻底
解决,对于novel/unknown mRNA,究竟哪个ATG才是起始ATG,还是需要实验来验证。
真核mRNA能同时编码2个甚至2个以上蛋白产物的情况也有,在病毒编码mRNA中尤其多见
。往往是第一起始ATG所处的context不那么理想,或者序列中包含IRES或存在其他内部
起始机制。另一方面,细胞内会随机出现从非标准起始ATG开始翻译的事件,但大多数
情况下会通过NMD机制来消除其负面效应。
此外,mRNA中标准起始ATG上游其他ATG(uATG)的存在是在翻译水平调控该蛋白表达的
机制之一,5'UTR中的uATG往往会负调控该蛋白的表达,通过干扰核糖体对标准起始ATG
的识别来实现。
【在 s*********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 问下,一个蛋白如果有好多个Met,每个ATG都有可能开始翻译吗?
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a*******a 发帖数: 4233 | 20 second this
detect
【在 s********x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大部分时候确实没必要去掉atg,但是偶尔会有内部initiation的时候。 : 很对时候可能是设计的atg附近序列缺乏足够强的ribosome识别,或者碰巧蛋白中段有 : 类似ires的序列。 : 如果出现突变掉atg就好了。 : 至于stop codon,一个确实有一定的读传概率,如果是舜转大量的dna,往往回detect : 读穿。但是如果是knock in 一两个copy,一般检测不到读穿,当然总会有微量的。每 : 次都加多个stop有点强迫,不过确实可能有帮助,只不过大多数没用。
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r******k 发帖数: 446 | 21 您好 sto condon应该加在那里呢?
加在NLS的后面 我要的gene的前面吗?
【在 q***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手 : 常犯的错误就是保留基因自身的ATG,有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白 : 表达。 : 另外一个应该特别注意的就是Stop Codon,在原核中表达就要用原核的常用的Stop : Codon,真核表达就用真核的,而且至少加两个,两个常用的,或一个常用,一个次常 : 用的。 : 做突变很可能在其他地方引入其他突变,如果用kit价格上很贵,不如重新做。 : 做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit. : http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification : http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation-
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