e********r 发帖数: 147 | 1 背景是:
1. 这是一个细菌的膜受体激酶,结晶测三维结构是不可能的,同类蛋白从来没人搞出
过全长的结构。
2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后,这个激酶的活性大大上升。
3. 通过alanine-scanning mutagenesis,发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
变后,解除了其对酶活性的抑制
。
4. 我们现在的working model是:ligand与receptor结合以后,通过构象变化和上述关
键氨基酸介导的某种机制,解除了autoinhibition,从而使这个激酸的活性区在dimer
中更靠近,从而提高了酶活性。
5.实验过程中必须用全长蛋白,也就是说得用liposome这一类的东西。截短蛋白木有活
性,也不能结合ligand.....
问题是:在结构生物学不可能实行的情况下,只能用遗传或生化的方法,咋去证明或否
定上面这个model呢?
谢谢! |
s******c 发帖数: 331 | 2 首先,不要说晶体结构不可能~
然后,很多方法,如果想知道dimer对活性的影响,不知道你这个蛋白多大,如果5次跨
膜以上12次跨膜以内,一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上,因为孔径的关系,
形成的基本是monomer,然后测活性。如果想定量看构象变化,最直接的方式就是
biophysics的方法,比如fluorescence based,或quenching,或fret,看构象变化,
还可以做EPR,可以看到两个residue之间距离的分布,但这些都要求site specific
labeling,需要你们能够大量表达纯化蛋白,另外也可以试cryoEM。
你们的working model基本是protein structure,protein conformational changes之
类的东西,这些想通过遗传实验的方法去证明,很难,生化也最多看看那些residues起
作用。 |
z********i 发帖数: 610 | 3 只要有活性就好说,首先要建立以测活assay,然后用一些方法使其dimerization,测
定活性是否增加。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】 : 背景是: : 1. 这是一个细菌的膜受体激酶,结晶测三维结构是不可能的,同类蛋白从来没人搞出 : 过全长的结构。 : 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后,这个激酶的活性大大上升。 : 3. 通过alanine-scanning mutagenesis,发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突 : 变后,解除了其对酶活性的抑制 : 。 : 4. 我们现在的working model是:ligand与receptor结合以后,通过构象变化和上述关 : 键氨基酸介导的某种机制,解除了autoinhibition,从而使这个激酸的活性区在dimer : 中更靠近,从而提高了酶活性。
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e********r 发帖数: 147 | 4 谢谢啊,很多信息。结构主要是我们这种实验室也不会做。你说的其它方法我先查下文
献,消化一下......。
【在 s******c 的大作中提到】 : 首先,不要说晶体结构不可能~ : 然后,很多方法,如果想知道dimer对活性的影响,不知道你这个蛋白多大,如果5次跨 : 膜以上12次跨膜以内,一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上,因为孔径的关系, : 形成的基本是monomer,然后测活性。如果想定量看构象变化,最直接的方式就是 : biophysics的方法,比如fluorescence based,或quenching,或fret,看构象变化, : 还可以做EPR,可以看到两个residue之间距离的分布,但这些都要求site specific : labeling,需要你们能够大量表达纯化蛋白,另外也可以试cryoEM。 : 你们的working model基本是protein structure,protein conformational changes之 : 类的东西,这些想通过遗传实验的方法去证明,很难,生化也最多看看那些residues起 : 作用。
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e********r 发帖数: 147 | 5 嗯,把它更多地变成dimerization,值得试试。
【在 z********i 的大作中提到】 : 只要有活性就好说,首先要建立以测活assay,然后用一些方法使其dimerization,测 : 定活性是否增加。 : : dimer
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e****s 发帖数: 1125 | 6 膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。
楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
的几篇文章,他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白,因为对微环境的变化非常
敏感。也可以做Quenching,但那需要有蛋白结构来设计。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】 : 背景是: : 1. 这是一个细菌的膜受体激酶,结晶测三维结构是不可能的,同类蛋白从来没人搞出 : 过全长的结构。 : 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后,这个激酶的活性大大上升。 : 3. 通过alanine-scanning mutagenesis,发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突 : 变后,解除了其对酶活性的抑制 : 。 : 4. 我们现在的working model是:ligand与receptor结合以后,通过构象变化和上述关 : 键氨基酸介导的某种机制,解除了autoinhibition,从而使这个激酸的活性区在dimer : 中更靠近,从而提高了酶活性。
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T*****e 发帖数: 247 | 7 不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer,但是在背景中没有再提
到dimer。
我根据你的介绍,和seraphzc的回复,提出这样一种想法:
不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解,比如GRASP,大概的意思就是把荧光
蛋白拆成两个部分,然后在A神经细胞表达其中一部分,再在B神经细胞表达另一部分。
如果这两个细胞靠的够近的话,你就能看到荧光。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
在你这种情况下,可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version(1)带部分
GFP,另一个version(2)带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer,那你应该能看
到荧光。
但你的model似乎有一点复杂。虽然你的标题说是看dimer的形成有没有变化。但实际上
,我不确定你想看到有或无的dimer结合,还是你model里面更具体的“激酶活性区更靠
近”。
如果是前者的话,你可以参考我上面提到的方法。如果是后者的话,设计起来可能更复
杂。你也许要用FRET,或者这篇文章能给你灵感。
http://www.nature.com/neuro/journal/v17/n6/full/nn.3709.html
希望对你有帮助。 |
s**i 发帖数: 4448 | |
U*****t 发帖数: 19 | 9 using bivalent ligand sounds a great idea. |
e********r 发帖数: 147 | 10 Bimane,新名词。谢谢,我去学习一下......
GPCR
【在 e****s 的大作中提到】 : 膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。 : 楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR : 的几篇文章,他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白,因为对微环境的变化非常 : 敏感。也可以做Quenching,但那需要有蛋白结构来设计。 : : dimer
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e********r 发帖数: 147 | 11 唉呀,版上牛人确实不少,谢谢。我们现在还没有更多的证据,不过估计dimer应该是
已经存在了,ligand上来并不促进dimer的形成,而是使dimer内部的kinase domain靠
得近。所以您说的第二种策略可能会有效,但第一种确实也需要考虑的。
【在 T*****e 的大作中提到】 : 不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer,但是在背景中没有再提 : 到dimer。 : 我根据你的介绍,和seraphzc的回复,提出这样一种想法: : 不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解,比如GRASP,大概的意思就是把荧光 : 蛋白拆成两个部分,然后在A神经细胞表达其中一部分,再在B神经细胞表达另一部分。 : 如果这两个细胞靠的够近的话,你就能看到荧光。 : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029 : 在你这种情况下,可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version(1)带部分 : GFP,另一个version(2)带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer,那你应该能看 : 到荧光。
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e********r 发帖数: 147 | 12 介是啥东东?待我查查先
【在 s**i 的大作中提到】 : bivalent ligand?
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I*********r 发帖数: 8 | 13 我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer?
如果你可以提纯蛋白,那做一个gel filtration,看看活性蛋白的大小,推测是否为
dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer,分别测定它们的活性啊。
或者是我理解错了?
dimer
【在 e********r 的大作中提到】 : 背景是: : 1. 这是一个细菌的膜受体激酶,结晶测三维结构是不可能的,同类蛋白从来没人搞出 : 过全长的结构。 : 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后,这个激酶的活性大大上升。 : 3. 通过alanine-scanning mutagenesis,发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突 : 变后,解除了其对酶活性的抑制 : 。 : 4. 我们现在的working model是:ligand与receptor结合以后,通过构象变化和上述关 : 键氨基酸介导的某种机制,解除了autoinhibition,从而使这个激酸的活性区在dimer : 中更靠近,从而提高了酶活性。
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T****u 发帖数: 424 | 14 膜蛋白,没法做。
【在 I*********r 的大作中提到】 : 我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer? : 如果你可以提纯蛋白,那做一个gel filtration,看看活性蛋白的大小,推测是否为 : dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer,分别测定它们的活性啊。 : 或者是我理解错了? : : dimer
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T****u 发帖数: 424 | 15 这是个结构生物学或者生物物理的问题,其他方法都很难直接证明。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】 : 背景是: : 1. 这是一个细菌的膜受体激酶,结晶测三维结构是不可能的,同类蛋白从来没人搞出 : 过全长的结构。 : 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后,这个激酶的活性大大上升。 : 3. 通过alanine-scanning mutagenesis,发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突 : 变后,解除了其对酶活性的抑制 : 。 : 4. 我们现在的working model是:ligand与receptor结合以后,通过构象变化和上述关 : 键氨基酸介导的某种机制,解除了autoinhibition,从而使这个激酸的活性区在dimer : 中更靠近,从而提高了酶活性。
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b******y 发帖数: 627 | 16 What kinase? Histidine kinase? |
c*******0 发帖数: 190 | 17 Check this one:
The ErbB4 CYT2 variant protects EGFR from ligand-induced degradation to
enhance cancer cell motility
http://stke.sciencemag.org/content/7/339/ra78.abstract
Dimerization of EGFR with an ErbB4 receptor variant increases growth factor
–induced migration of breast cancer cells |
m*******7 发帖数: 85 | 18 你可以去试下做hydrogen deutium exchange,比较下蛋白加ligand 和没加下的
exchange rate。还可以试下light scattering,这个可以算出体系中monomer,dimer
等的量。 |
d******r 发帖数: 244 | |