T*****e
发帖数: 247 | 1 不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer，但是在背景中没有再提
到dimer。
我根据你的介绍，和seraphzc的回复，提出这样一种想法：
不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解，比如GRASP，大概的意思就是把荧光
蛋白拆成两个部分，然后在A神经细胞表达其中一部分，再在B神经细胞表达另一部分。
如果这两个细胞靠的够近的话，你就能看到荧光。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
在你这种情况下，可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version（1）带部分
GFP，另一个version（2）带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer，那你应该能看
到荧光。
但你的model似乎有一点复杂。虽然你的标题说是看dimer的形成有没有变化。但实际上
，我不确定你想看到有或无的dimer结合，还是你model里面更具体的“激酶活性区更靠
近”。
如果是前者的话，你可以参考我上面提到的方法。如果是后者的话，设计起来可能更复
杂。你也许要用FRET，或者这篇文章能给你灵感。
http://www.nature... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 2 方法很多：
一种是稳定的dimer，比如二硫键形成的dimer，SDS lysis buffer 也不能破坏，
Western blot会有两条带，刚好两倍差别。一定要确定的话可以IP后可以mass-spec
二假如SDS lysis buffer 会破坏，可以先IP后，sucrose gradient或是分子量层析，
至少有2个component
三，假如蛋白能纯化出来的，就更容易了。直接GST-protein过分子筛。
四，IP或pull down用外源蛋白可以沉淀下endogenous protein，说明可以形成dimer或
polymer
五，X-ray and structural determination确定dimer结构 |
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I*********r
发帖数: 8 | 3 我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer?
如果你可以提纯蛋白，那做一个gel filtration，看看活性蛋白的大小，推测是否为
dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer，分别测定它们的活性啊。
或者是我理解错了？
dimer |
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n****e
发帖数: 1677 | 4 I used to make different constructs for 1 protein, they are all soluble, but
behave different, some are monomer, inactive, some are dimer inactive, some
are dimer active can't crystallize, some are dimer active can
crystallize......
And the difference between these constructs are just around 10 residues.
所不
另一
而不
来就 |
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g***j
发帖数: 40861 | 5 正在构建一个质粒，挺简单，就是把这个质粒上的gfp换成同样大小的dsRed,质粒的骨
干不变。
连接，转化以后，有不少菌落。
第一天挑了4个菌落，长在LB里，amp浓度100ug/ml.结果只长了一个。试剂盒提质粒，
solution3 以后离心，结果上清非常浑浊，白色的东西离不下去。继续做，提完，跑胶
，没质粒。
第二天，又挑了4个菌落，长在LB里，amp浓度50ug/ml。4个都长了，试剂盒提质粒。同
样，solution3 以后离心，结果上清非常浑浊，白色的东西离不下去。继续做，提完，
跑胶，都有质粒。质粒大小和原质粒dimer 一样大。单切，跑胶，3个切不开，1个切开
后和原质粒单切大小一样。更加确定是形成dimer了。
问题一，为啥会形成dimer呢？
问题二，我是重新做连接，转化呢？还是把那个能切开的切一下，然后稀释，连接，再
转化呢？ |
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e********r
发帖数: 147 | 6 唉呀，版上牛人确实不少，谢谢。我们现在还没有更多的证据，不过估计dimer应该是
已经存在了，ligand上来并不促进dimer的形成，而是使dimer内部的kinase domain靠
得近。所以您说的第二种策略可能会有效，但第一种确实也需要考虑的。 |
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n****e
发帖数: 1677 | 7 可能我说的不太清楚，我解释一下，在表达一个蛋白质前，首先要做的是blast,
找到保守序列，然后设计constructs，比如我做的蛋白，保守序列是1500-2183，
那我这样设计construct,
N-terminal:1400,1409,1419,1429,1439,1449
C-terminal:2233,2223,2213,2203
这些加一起可以做24个constructs,我表达的结果1429-2233表达，很稳定，dimer,active
,crystallized,然后crystal structure表明在N-terminal和
C-terminal各有几十个残基disorder,然后我就在crystal structure基础上
再设计一些constructs,把disorder的残基cut掉，结果我又表达了几个
constructs,包括1476-2233,1476-2189,1495-2233,1495-2189等等。然后结果
就比较有趣了。
上面四个都表达可溶稳定，不同的是，1476-2233,1495-2233是dimer,active,
1476-21 |
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t****u
发帖数: 10218 | 8 I wasn't talking about the crystal structure either.:)
I thought in the pulldown exp. you had a GST fusion to pull-down another
version of your protein, is that right? I am concerning about that your
GST-fusions are so geographically close to each other there will be very
little chance to form a GST-protein/protein dimer. Most of them will be
GST-protein/GST-protein dimer, that's why "E coli. 表达纯化的yeast蛋白不能形成
二聚体 （GST pulldown)".
But I'm just speculating, didn't know your exp. detail.
maybe
的修饰 |
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h****k
发帖数: 182 | 9 谢ls，如果蛋白本身是单体，使用crosslinking后会不会造成假象，检测结果为dimer
或者multimer??
另外co-IP的时候使用该receptor的抗体，如果是单体，该抗体会不会聚集这些
receptor,而成为dimer或者multimer?? |
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S****r
发帖数: 982 | 10 Cysteine-trap is a regular approach to confirm dimer of membrane proteins.
dimer
No. SDS-PAGE, reducing or non-reducing environment, depending on the linkers
you chosen.
No, SDS-PAGE |
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T****i
发帖数: 15191 | 11 理论上来说，做两个constructs，分别用两个不同的tag，＋／－ DNase，然后IP/
western。这能证明是dimer 或更大。如果需要证明不是trimer, tetramer，。。。就
是dimer，需要分子筛。 |
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d*****s
发帖数: 647 | 12 我们以前做过eNOS的dimer和monomer，程序如下：
正常提取蛋白，按照常规Western Blot准备标本
将标本分为2份：一份boiled，一份unboiled
在4度下跑SDS-PAGE胶
然后Western blot程序
最好在胶片上判断：Boiled的标本只有1条monomer带，unboiled的标本在2倍monomer分
子量位
置有条带表示是dimer |
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l******n
发帖数: 143 | 13 这个俺尝试回答一下
1.你的gel是native or denatured?如果是denatured,一般非共价键的homo-dimer会分
离成monomer.
2.似乎不太明白你的描述left lane and right lane哪个蛋白被过表达?
3.可以跑个简单的MALDI-TOF质谱检测一下那个>50 kD的band是不是确定存在
4.如果你的gel是native gel without reducing reagent,你的蛋白质(们)会不会在空
气中氧化形成共价disulfide bond,可以很简单地加点还原剂做对比实验.
5.条件允许的情况下用分析超高速离心sedimentation velocity analytical
ultracentrifugation跑几个不同浓度的样品,看一看有没有reversible dimerization
进行,或者这两个条带分别是两个不相互作用的蛋白质,这个方法比SEC柱子resolution
高很多.
6.co-IP的artifect不少,最好用其他方法检验来确认
希望能帮到你哈
50KDa |
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z********i
发帖数: 610 | 14 只要有活性就好说，首先要建立以测活assay，然后用一些方法使其dimerization，测
定活性是否增加。
dimer |
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A*S
发帖数: 354 | 15 other than D-dimer, any other tests or exam? like EKG, Ultrasound, chest x-
ray? any other past history? family history?
more info. may help Dr. garland give you more appropriate advice. |
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a***e
发帖数: 1010 | 16 GST is very easy to form dimer. |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 这个应该也可以。但是我担心protein A or G 的binding domain 有人
单独用过么？就是不包含其他序列，光用那个binding domain，能和Fc 里面的
单独的motif结合么？
GST蛋白不行。太大，而且GST 会导致转录出来的蛋白直接就成了homodimer 了。
其实，我刚才想了一下，发现不能用dimerization domain, 因为一旦成了
homodimer 就麻烦了，最好还是heterodimer, 象你说的那个Protein G + Fc domain |
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h****k
发帖数: 182 | 18 请问有什么好的方法或者实验可以检测membrane bound receptor 是monomer，dimer,
还是multimer？ |
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h****k
发帖数: 182 | 19 谢谢ls。我会先选择native gel试试看。另外sec不可行因为蛋白量不够。还有cross
linking可能会把本来是monomer的link成dimer 或者multimer?? 感觉不对。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 对，cross linking做的本身的意义就在于把两个东西（大多数时候是两个肽链，或者
是一个肽链一
个marker）用共价键相连，所以一条肽链内的cross linking其实是要避免的。在研究
两个肽链（可
以相同也可能不同）的相对空间位置的时候可以用cross linking提供一些有用的信息
。所以如果你
的蛋白本身是dimer，或者trimer，理论上说可以用cross linking的方式“固定”下来。 |
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g*****d
发帖数: 27 | 21 增加template, 用水做control，用不同的DNA做template都会出现dimers, 没有任何
products. |
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g*****d
发帖数: 27 | 22 谢谢楼上的，不同的primers都试过了，不同的水也试过了，不同的dNTP
concentration也试过了。用的是bulldog的Taq，都会出现size相同的dimers. 但是奇
怪的是用QPCR的mastermix试过后，出现了不同Size的bands。真是相当奇怪。
sequence在lab的电脑上，周一才能拿到。请楼上的兄弟帮忙分析下，谢谢。 |
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g***j
发帖数: 40861 | 23 谢谢，是要重做。
另外我想问是不是dimer既有可能是形成一个大环，也有可能形成两个小环套在一起？
不过要是后者，感觉没法一直复制了啊。 |
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t**l
发帖数: 109 | 24 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer |
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a*******e
发帖数: 245 | 26 你说得对
gst 可以induce target protein to form dimer
所以gst tag 不是一个非常好的手段 |
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g*****p
发帖数: 451 | 28 这么多tag的例子你不举，偏偏举这个
gst is naturally a dimer |
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b******s
发帖数: 1089 | 29 跟帖问一句。证明一个TF是dimer还是monomer有什么大的生物学意义吗？当然可能对TF
的function, mobility等有潜在的调控作用。但在我做的传统发育里，看到的大部分都
还是集中在TF的调控基因上。 |
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H*******i
发帖数: 196 | 30 LacI的monomer dimer tetramer对synthetic biology的一些设计就很重要，会直接影
响能观测到的现象/表型
而且简单的hill function对很多相关动力学现象的解释就不好，需要加入时间参数，
这个和多聚体就很有关系了。 |
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l****j
发帖数: 70 | 31 我用一种抗体检测出了两条带，一般都认为目的条带在25KDa左右，但是我发现在50KDa
上面还有另外一条，left line是对照组，right line是过表达另外一种蛋白质后，
25KDa的表达减少，50KDa上面的条带表达增多而且分子量更高了，
这是什么情况？是蛋白质修饰 or 两种蛋白质binding or self-dimer?怎样能检测出来
？
哪位有经验的前辈帮忙分析一下吧，先谢过 |
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e****s
发帖数: 1125 | 32 我会先试Co-IP
对于self-dimer,标上不同的tag，用一个Co-IP或者pull-down另一个。
50KDa |
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l****j
发帖数: 70 | 33 多谢回复！
1.denature的western blot gel
2.右边是过表达的。
3.直接在膜上测吗？我再找找方法。以前用IP的gel做过测序，50多KDa附近的都被
heavy chain cover了。
4.native gel 不加还原剂，蛋白质的分子量都变了吧。我做的是denature的，加了巯
基乙醇。
5.分析超高速离心机没有的。
6.我也在找避免artifect的方法。
dimerization
resolution |
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m****b
发帖数: 32 | 34 喜欢这样scientific的话题。
我是外行，很少做蛋白。我猜想能否把50kda的分析一下amino acid组成，如果和25的
一样，是否支持dimer，可以进一步证明呢 |
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l****j
发帖数: 70 | 35 欢迎讨论啊！
我做蛋白但也是外行，很多不懂的。
我真正关心的并不是dimer的问题，如果是两个不同蛋白质之间binding就更好了。 |
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e********r
发帖数: 147 | 36 背景是：
1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
过全长的结构。
2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
变后，解除了其对酶活性的抑制
。
4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
中更靠近，从而提高了酶活性。
5.实验过程中必须用全长蛋白，也就是说得用liposome这一类的东西。截短蛋白木有活
性，也不能结合ligand.....
问题是：在结构生物学不可能实行的情况下，只能用遗传或生化的方法，咋去证明或否
定上面这个model呢？
谢谢！ |
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s******c
发帖数: 331 | 37 首先，不要说晶体结构不可能~
然后，很多方法，如果想知道dimer对活性的影响，不知道你这个蛋白多大，如果5次跨
膜以上12次跨膜以内，一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上，因为孔径的关系，
形成的基本是monomer，然后测活性。如果想定量看构象变化，最直接的方式就是
biophysics的方法，比如fluorescence based，或quenching，或fret，看构象变化，
还可以做EPR，可以看到两个residue之间距离的分布，但这些都要求site specific
labeling，需要你们能够大量表达纯化蛋白，另外也可以试cryoEM。
你们的working model基本是protein structure，protein conformational changes之
类的东西，这些想通过遗传实验的方法去证明，很难，生化也最多看看那些residues起
作用。 |
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e********r
发帖数: 147 | 38 嗯，把它更多地变成dimerization，值得试试。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 39 膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。
楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
的几篇文章，他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白，因为对微环境的变化非常
敏感。也可以做Quenching，但那需要有蛋白结构来设计。
dimer |
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T****u
发帖数: 424 | 40 这是个结构生物学或者生物物理的问题，其他方法都很难直接证明。
dimer |
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c*******0
发帖数: 190 | 41 Check this one:
The ErbB4 CYT2 variant protects EGFR from ligand-induced degradation to
enhance cancer cell motility
http://stke.sciencemag.org/content/7/339/ra78.abstract
Dimerization of EGFR with an ErbB4 receptor variant increases growth factor
–induced migration of breast cancer cells |
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m*******7
发帖数: 85 | 42 你可以去试下做hydrogen deutium exchange，比较下蛋白加ligand 和没加下的
exchange rate。还可以试下light scattering，这个可以算出体系中monomer，dimer
等的量。 |
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q********g
发帖数: 10694 | 43 Sobereva
Department of Chemistry, University of Science and Technology Beijing,
Beijing 100083, China
前言：本文主要介绍过渡态、反应路径的计算方法，并讨论相关问题。由于这类算法极
多，可以互相组合，限于精力不可能面面俱到展开，所以只介绍常用，或者实用价值有
限但有启发性的方法。文中图片来自相关文献，做了一定修改。由于本文作为帖子发布
，文中无法插入复杂公式，故文中尽量将公式转化为文字描述并加以解释，这样必然不
如公式形式严谨，而且过于复杂的公式只能略过，但我想这样做的好处是更易把握方法
的梗概，有兴趣可以进一步阅读原文了解细节。对于Gaussian中可以实现的方法，文中
对其在Gaussian中的使用进行了一些讨论，希望能纠正一些网上流传的误区。虽然绝大
多数人不专门研究计算方法，其中很多方法也不会用到，但多了解一下对开阔思路是很
有好处的。
文中指的“反应”包括构象变化、异构化、单分子反应等任何涉及到过渡态的变化过程
。“反应物”与“产物”泛指这些过程的初态和末态。“优化”若未注明，... 阅读全帖 |
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H**T
发帖数: 3007 | 44 脑残还是咋地？！阅读水平这么差还做科研，还出来现？！
人家讨论的是最小的band，是primer dimer! 不是中间的bands.primer dimer是50bp左
右的band,明白了吗？primer dimer当热不是editing的产物!
didi @monkeydidi Jul 15
@GaetanBurgio That looks promising. What DNA ladder did you use? Is the
smallest band in wildtype control primer dimers?
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Gaetan Burgio @GaetanBurgio Jul 15
@monkeydidi 50 bp ladder. smallest bands are dimers, not editing.
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didi @mon... 阅读全帖 |
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L*****r
发帖数: 722 | 45 二。PE 的诊断流程：
UPTODATE的推荐，是对临床怀疑PE 的患者:
1. 首先计算pretest probability （Wells score）
2. 如果High score, 就做CT-angio，或确诊或除外PE;
3. 如果intermediate or low, 就先做D-Dmer:
4. 如果D-Dimer 阴性，则除外了PE；如果D-Dimer 阳性，对不起，go to 2 (还要做CT
-angio)。
然而实际操作起来，又有很多变数：
1。首先，临床怀疑PE，各个医生的临床判断之间就差别很大，而D-Dimer假阳性率又相
当高，所以，如果按UPTODATE的推荐，势必有很多病人无辜而无奈地接受CT-angio或V/
Q scan。设想这么一个病人：本来临床怀疑PE就可有可无，就因为INTERN order了D-
Dimer，而结果又不幸是阳性，按常规只好做CT-angio或V/Q scan可是这个患者肾功能
不好禁忌做CT-angio，而同时呼吸功能不好很难做V/Q scan，这时候你怎么办呢？Get
stuck! 还不如不做D-Dimer。
所以，INT... 阅读全帖 |
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b******a
发帖数: 704 | 46 D-dimer is non-specfic, but sensitive with a good NPV for PE. a D-dimer
level <500 ng/mL is sufficient to exclude PE in patients with a LOW or
MODERATE pretest probability of PE. But a positive D-dimer doesn't mean
anything. In this case, severe liver disease (decreased clearance) and
infection/inflammation could cause the abnormal elevation of D-dimer.
Disorders associated with increased plasma levels of fibrin D-dimer:
Arterial thromboembolic disease (Myocardial infarction ,Stroke , Acute limb... 阅读全帖 |
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E*********o
发帖数: 5965 | 47 本版发贴的左逼主要分两种：廊坊五毛和猪党dimer
廊坊五毛和猪党dimer不是同主，也没有战略关联，偶尔有些自带干粮的左逼没有主子
但是也可以辨别，就是没有什么逻辑，被打脸了就打滚
廊坊五毛现在经费严重不足，回帖已经不给钱了。
猪党dimer现在一个贴10美分所以叫dimer，这些人招募主要是三个渠道：公立大学、
Craigslist上左媒实习生和社区基层community organizer发展起来的龙虾党。
大家可以回帖把这些人的ID都总结出来 |
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A********e
发帖数: 354 | 48 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: albertsmwk (.)(.), 信区: Biology
标 题: 第一批“青年千人计划”生物类@publication列表@
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branche... 阅读全帖 |
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p*******g
发帖数: 2976 | 49 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: albertsmwk (.)(.), 信区: Biology
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发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
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125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branche... 阅读全帖 |
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O***n
发帖数: 13127 | 50 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
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标 题: 第一批“青年千人计划”生物类@publication列表@
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
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125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
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