y********8 发帖数: 23 | 1 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白, 这个蛋白活性对oxygen极为敏感,
至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。
第一次把此蛋白在细胞质中表达,没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中
有酶活?把它在mitochondria中表达, 是否有帮助?
谢谢!!! |
j****n 发帖数: 3370 | 2 厌氧没法做?不然细胞里或多或少有氧气吧,加上你的是极为敏感。。。
ps haoqiwemxia蛋白,是pfl?
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【在 y********8 的大作中提到】 : 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白, 这个蛋白活性对oxygen极为敏感, : 至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。 : 第一次把此蛋白在细胞质中表达,没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中 : 有酶活?把它在mitochondria中表达, 是否有帮助? : 谢谢!!!
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y********8 发帖数: 23 | |
e****s 发帖数: 1125 | 4 这个估计只能在无氧条件下提,
还原态的Fe才是有活性的,O2是底物之一吧?你的铁已经是三价了,失去了被氧化的能
力,也就没有活性了。
如果没有无氧的条件,试试看提纯过程中加入适量DTT之类,同时把Buffer都Degas一下
。测活的时候再输入额外的O2。
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【在 y********8 的大作中提到】 : 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白, 这个蛋白活性对oxygen极为敏感, : 至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。 : 第一次把此蛋白在细胞质中表达,没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中 : 有酶活?把它在mitochondria中表达, 是否有帮助? : 谢谢!!!
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l****3 发帖数: 399 | |
j****n 发帖数: 3370 | 6 如果是在yeast等耗氧厉害的host做
可以直接加到厌氧管 密封好
少量氧气很快被消耗掉 就成厌氧环境了
用这个至少pfl可以功能表达 我们做过 其他类型protein的就不知道了
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【在 y********8 的大作中提到】 : yes
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