z*******9 发帖数: 112 | 1 我用Lenti-X lentiviral vector (EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
glycoprotein,在其C端与GFP marker之间,我加上了一Protease 2AA site,我认为这
样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达,
结果却不是我预测的,我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白,
请问,各位做细胞系的大牛有何建议,谢谢 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 这个和lentiviral不一定有直接关系。我建议你先把那个载体直接表达在293T cell 里
面(不需要加包装载体),看看能不能表达出来两个蛋白。
【在 z*******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用Lenti-X lentiviral vector (EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral : glycoprotein,在其C端与GFP marker之间,我加上了一Protease 2AA site,我认为这 : 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达, : 结果却不是我预测的,我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白, : 请问,各位做细胞系的大牛有何建议,谢谢
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z*******9 发帖数: 112 | 3 谢谢,我现在正在监测他在293T里的情况,
只是觉得这个也太Counter Intuitive 了, |
s******s 发帖数: 13035 | 4 你看看GFP前面有没有独立的ATG能单独表达的?要么就是你的蛋白实在太不稳定了。
你有没有用GFP抗体做一下western看一下大小?
293T里面比较tricky。我的理解是这玩意儿根本不需要经过mRNA,直接就是病毒RNA表
达了。
【在 z*******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢,我现在正在监测他在293T里的情况, : 只是觉得这个也太Counter Intuitive 了,
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l***y 发帖数: 638 | 5 测个mRNA,看看有没有GFP的mRNA上还有没有目标蛋白序列连着,可能就是目标蛋白表达
太低,或者有毒性被select against了丢了只剩GFP了
【在 z*******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用Lenti-X lentiviral vector (EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral : glycoprotein,在其C端与GFP marker之间,我加上了一Protease 2AA site,我认为这 : 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达, : 结果却不是我预测的,我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白, : 请问,各位做细胞系的大牛有何建议,谢谢
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z*******9 发帖数: 112 | 6 谢谢各位的建议,
我首先监测了在293T trasfection时,蛋白的表达,IFA结果表明我目标蛋白表达良好
,基本是有GFP信号的细胞,目标蛋白都是表达的,
接着,我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot,这次两次监测的结
果都是阳性,我都能监测到目标蛋白(这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能
是抗体的原因)
不过,对细胞株的IFA又看到一个现象,我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合,我可以
观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号,或者反之,(重复一下,
我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)?
请问各位,这是不是经常出现的现象? |
v**********m 发帖数: 5516 | 7 2AA的linker在细胞内被非特异性剪切。gfp fusion常见的现象。
【在 z*******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢各位的建议, : 我首先监测了在293T trasfection时,蛋白的表达,IFA结果表明我目标蛋白表达良好 : ,基本是有GFP信号的细胞,目标蛋白都是表达的, : 接着,我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot,这次两次监测的结 : 果都是阳性,我都能监测到目标蛋白(这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能 : 是抗体的原因) : 不过,对细胞株的IFA又看到一个现象,我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合,我可以 : 观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号,或者反之,(重复一下, : 我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)? : 请问各位,这是不是经常出现的现象?
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v**********m 发帖数: 5516 | 8 有gfp,没你蛋白的情况也会很常见。
【在 z*******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用Lenti-X lentiviral vector (EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral : glycoprotein,在其C端与GFP marker之间,我加上了一Protease 2AA site,我认为这 : 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达, : 结果却不是我预测的,我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白, : 请问,各位做细胞系的大牛有何建议,谢谢
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