z*******9
发帖数: 112 | 1 我用Lenti-X lentiviral vector （EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
glycoprotein,在其C端与GFP marker之间，我加上了一Protease 2AA site，我认为这
样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达，
结果却不是我预测的，我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白，
请问，各位做细胞系的大牛有何建议，谢谢 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 这个和lentiviral不一定有直接关系。我建议你先把那个载体直接表达在293T cell 里
面（不需要加包装载体），看看能不能表达出来两个蛋白。
【在 z*******9 的大作中提到】
: 我用Lenti-X lentiviral vector （EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
: glycoprotein,在其C端与GFP marker之间，我加上了一Protease 2AA site，我认为这
: 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达，
: 结果却不是我预测的，我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白，
: 请问，各位做细胞系的大牛有何建议，谢谢
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z*******9
发帖数: 112 | 3 谢谢，我现在正在监测他在293T里的情况，
只是觉得这个也太Counter Intuitive 了， |
s******s
发帖数: 13035 | 4 你看看GFP前面有没有独立的ATG能单独表达的？要么就是你的蛋白实在太不稳定了。
你有没有用GFP抗体做一下western看一下大小？
293T里面比较tricky。我的理解是这玩意儿根本不需要经过mRNA，直接就是病毒RNA表
达了。
【在 z*******9 的大作中提到】
: 谢谢，我现在正在监测他在293T里的情况，
: 只是觉得这个也太Counter Intuitive 了，
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l***y
发帖数: 638 | 5 测个mRNA，看看有没有GFP的mRNA上还有没有目标蛋白序列连着，可能就是目标蛋白表达
太低，或者有毒性被select against了丢了只剩GFP了
【在 z*******9 的大作中提到】
: 我用Lenti-X lentiviral vector （EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
: glycoprotein,在其C端与GFP marker之间，我加上了一Protease 2AA site，我认为这
: 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达，
: 结果却不是我预测的，我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白，
: 请问，各位做细胞系的大牛有何建议，谢谢
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z*******9
发帖数: 112 | 6 谢谢各位的建议，
我首先监测了在293T trasfection时，蛋白的表达，IFA结果表明我目标蛋白表达良好
，基本是有GFP信号的细胞，目标蛋白都是表达的，
接着，我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot，这次两次监测的结
果都是阳性，我都能监测到目标蛋白（这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能
是抗体的原因）
不过，对细胞株的IFA又看到一个现象，我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合，我可以
观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号，或者反之，（重复一下，
我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)?
请问各位，这是不是经常出现的现象？ |
v**********m
发帖数: 5516 | 7 2AA的linker在细胞内被非特异性剪切。gfp fusion常见的现象。
【在 z*******9 的大作中提到】
: 谢谢各位的建议，
: 我首先监测了在293T trasfection时，蛋白的表达，IFA结果表明我目标蛋白表达良好
: ，基本是有GFP信号的细胞，目标蛋白都是表达的，
: 接着，我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot，这次两次监测的结
: 果都是阳性，我都能监测到目标蛋白（这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能
: 是抗体的原因）
: 不过，对细胞株的IFA又看到一个现象，我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合，我可以
: 观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号，或者反之，（重复一下，
: 我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)?
: 请问各位，这是不是经常出现的现象？
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v**********m
发帖数: 5516 | 8 有gfp，没你蛋白的情况也会很常见。
【在 z*******9 的大作中提到】
: 我用Lenti-X lentiviral vector （EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
: glycoprotein,在其C端与GFP marker之间，我加上了一Protease 2AA site，我认为这
: 样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达，
: 结果却不是我预测的，我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白，
: 请问，各位做细胞系的大牛有何建议，谢谢
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