P*******D
发帖数: 523 | 1 请教一下大家，我们最近develop了一个能在live cell里面定量glutathione的
fluorescent probe，大家有什么建议，可以回答什么important的biological
questions？
Invitrogen卖一个叫thioltracker violet的probe，但是这个不能定量，只能定性的看
一下GSH的变化。尽管GSH probe的文章都发烂了，也没有一个能在live cell里面定量
的。
我们develop了一个probe （ThiolQuant Green）可以很好的定量细胞里面的GSH (
reduced form only)。我们把这个probe用于confocal microscope和flow cytometry，
能很好的和cell lysate GSH measurement correlate.
相比起来redox GFP or YFP，ThiolQuant Green是直接测量reduced form GSH，而不是
measure GSSG GSH ratio。我们的probe potentially和roGFP complimentary。用起来
比roGFP方便些。
如果感兴趣的话，文章在这里 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb500986w
想请教一下有什么关于应用的建议和probe需要改进的地方，谢谢！
另外，如果想用ThiolQuant Green的，也可以和我联系，谢谢！ |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 我记得monochlorobimane就可以做这个
invitrogen有的卖的
你先看看你们的优势在哪里 |
P*******D
发帖数: 523 | 3 谢谢你的回复。
这些invitrogen卖的probe，我们都研究过，而且我也和invitrogen R&D联系过，
invitrogen他们承认他们的probe都不能在live cell里面定量，所以对我们的probe很
感兴趣。
我先讲一下为什么commercially available的probe不能很好的在live cell里面定量：
1.现在卖的所有的GSH或者thiol probe都是基于不可逆反应的，例如monochlorobimane
。一般按照invitrogen的protocol，加10-20 uM的probe和GSH反应，反应后，产物发出
荧光signal。这里的主要challenge是GSH的浓度非常高，一般是1-10 mM。如果是uM的
probe和mM的GSH反应，如果给足够的反应时间的话，不论你是1 mM GSH，还是10 mM
GSH，所有的probe都会被consume掉，所以得到同样的荧光output。
2. one can argue，如果GSH和probe反应足够慢的话，低浓度的GSH反应就会更慢，高
浓度GSH反应快，这样就能区分出GSH浓度的高低。这是理论上是正确的，但是操作起来
很tricky，你得确保所有的细胞都是同时readout荧光，而且得确保probe没有被完全反
应掉，否则信号被saturate了，就不准了。
3. one can also argue，如果probe浓度高于10 mM，那就即使反应完全，也能反映出
细胞GSH的浓度。但是加10 mM的probe，细胞能活下来就不错了。这个more like一个
chemist的想法，biologist肯定不prefer这个方法。
我们的probe的优势是：
1. ThiolQuant Green是基于可逆反应的，probe加到细胞里面，半小时就达到平衡，信
号就不变了，所以可以用uM的probe，去detect mM的GSH，只要确保probe和GSH的平衡
常数在desire的范围之内就可以。
2. 因为我们的probe是可逆的，所以可以monitor GSH的dynamics，这是不可逆probe不
可能做到的。
3. 和roGFP相比，roGFP一般用的form都是Grx1-roGFP2的fusion，overexpress Grx1本
身可能改变细胞的redox，但是小分子的probe理论上不会改变cell的redox。
Thx!
【在 h*******o 的大作中提到】
: 我记得monochlorobimane就可以做这个
: invitrogen有的卖的
: 你先看看你们的优势在哪里
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s******y
发帖数: 28562 | 4 我觉得这个很有用！
【在 P*******D 的大作中提到】
: 请教一下大家，我们最近develop了一个能在live cell里面定量glutathione的
: fluorescent probe，大家有什么建议，可以回答什么important的biological
: questions？
: Invitrogen卖一个叫thioltracker violet的probe，但是这个不能定量，只能定性的看
: 一下GSH的变化。尽管GSH probe的文章都发烂了，也没有一个能在live cell里面定量
: 的。
: 我们develop了一个probe （ThiolQuant Green）可以很好的定量细胞里面的GSH (
: reduced form only)。我们把这个probe用于confocal microscope和flow cytometry，
: 能很好的和cell lysate GSH measurement correlate.
: 相比起来redox GFP or YFP，ThiolQuant Green是直接测量reduced form GSH，而不是
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y****6
发帖数: 196 | 5 申请专利了吗？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1
【在 s******y 的大作中提到】
: 我觉得这个很有用！
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P*******D
发帖数: 523 | 6 申了，structure和derivative都protect了，多谢提醒。我感觉还是能有用的，不知道
有多少lab对这个东西感兴趣。
【在 y****6 的大作中提到】
: 申请专利了吗？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1
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P*******D
发帖数: 523 | 7 胖老师给讲讲咋用呀，谢谢
【在 s******y 的大作中提到】
: 我觉得这个很有用！
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s******e
发帖数: 163 | |
l******a
发帖数: 3339 | 9 看起来确实不错，话说acs chem bio一直是我喜欢看的杂志之一，我自己也发过两篇了
，可惜影响因子就是上不去，去国内找工作居然排在生物类三区，我心里一万个草泥马
。。。（放在化学类二区也行啊）
【在 P*******D 的大作中提到】
: 请教一下大家，我们最近develop了一个能在live cell里面定量glutathione的
: fluorescent probe，大家有什么建议，可以回答什么important的biological
: questions？
: Invitrogen卖一个叫thioltracker violet的probe，但是这个不能定量，只能定性的看
: 一下GSH的变化。尽管GSH probe的文章都发烂了，也没有一个能在live cell里面定量
: 的。
: 我们develop了一个probe （ThiolQuant Green）可以很好的定量细胞里面的GSH (
: reduced form only)。我们把这个probe用于confocal microscope和flow cytometry，
: 能很好的和cell lysate GSH measurement correlate.
: 相比起来redox GFP or YFP，ThiolQuant Green是直接测量reduced form GSH，而不是
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A******y
发帖数: 2041 | 10 It is very useful at monitoring cellular redox states and using microscopy,
you might be able to see if you are depleting specific GSH population (i.e.
mito vs cyto). Get a good price from invitrogen, you could be rich.
【在 P*******D 的大作中提到】
: 胖老师给讲讲咋用呀，谢谢
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w********y
发帖数: 288 | 11 很有用，如果能很方便的deliver到tissue culture甚至live animal就牛大了；我当年
做Ph.D课题的时候要有这个就好了！ |
P*******D
发帖数: 523 | 12 影响因子这个东西就是简单粗暴的评价一个工作，但对于外行也没啥好方法。
说起来这篇paper，也是一个long story。我自己也发过一些jacs paper，但是我自己
觉得这个work是我so far做的最有用的一个。我就投了一圈化学的杂志，jacs，angew
，chemical science，chemical communications，全部没有被review。后来就try了
analytical chemistry，好歹给review了。回来后，一个review非常positive，一个人
非常negative，悲剧了。这前后搞了半年，当时很frustrated，打算干脆尼玛发自己网
站上，就是对student不fair。我就联系了invitrogen，他们确实很懂，比较识货，然
后我们赶紧申请了专利。后来投的ACS chem bio。
ACS chem bio的reviewer非常helpful，尽管很tough，但是提的问题都很好，我们又狂
做了一堆实验，resubmit了两次，最后才接收。
looking back，很感谢当时据我们的journals，如果他们接收了，我们也不会去接触
invitrogen然后去patent了。
【在 l******a 的大作中提到】
: 看起来确实不错，话说acs chem bio一直是我喜欢看的杂志之一，我自己也发过两篇了
: ，可惜影响因子就是上不去，去国内找工作居然排在生物类三区，我心里一万个草泥马
: 。。。（放在化学类二区也行啊）
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P*******D
发帖数: 523 | 13 恩，我们正在做organelle specific的probe。目前作为global GSH的monitor没有问题
，也很方便。live animal，我估计zebrafish没问题, :)
如果是mice，就有荧光penetration的问题，我们也在想一些办法解决这个，但是确实
想做到animal上。
【在 w********y 的大作中提到】
: 很有用，如果能很方便的deliver到tissue culture甚至live animal就牛大了；我当年
: 做Ph.D课题的时候要有这个就好了！
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A******y
发帖数: 2041 | 14 For mice, there are other way to solve the penetration issue such as
intravital imaging.
【在 P*******D 的大作中提到】
: 恩，我们正在做organelle specific的probe。目前作为global GSH的monitor没有问题
: ，也很方便。live animal，我估计zebrafish没问题, :)
: 如果是mice，就有荧光penetration的问题，我们也在想一些办法解决这个，但是确实
: 想做到animal上。
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s******y
发帖数: 28562 | 15 这么说吧，潜在的应用前途太多了，多得我一下子不知道怎么说才好。这么说吧，这个
东西的用途和以前的钙离子成像的用途几乎一样重要。
细胞内的氧化/还原状态一向是一个非常重要的话题，尤其是整个生物领域往生理倾斜
的过程中，如何对氧化/还原状进行定量评估一直是个重要问题。现有的几个工具（比
方说那几个荧光蛋白）都有背景过高而且不准确的问题。你们做的probe如果能解决这
个问题的话会有大用处。
不过，这里有几个问题你们可能需要解决：
1。 对于细胞有无毒性？尤其是长期培养
2。 反应速度如何？
3。 可逆性够不够高？（这个会决定你们的定量线性程度）
至于在动物内部，这个目前不需要太着急。只要能够对肿瘤这种小局部的组织能用就行。
【在 P*******D 的大作中提到】
: 胖老师给讲讲咋用呀，谢谢
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w********y
发帖数: 288 | 16 您这global GSH指的是全细胞是吧，我觉得已经足够好了；live animal是长远的用途
，要做但也不急。我个人比较关心tissue culture上能不能用。毕竟很多probe发明出
来，isolated cell culture看着还行，上到组织水平就不好用了，于是在生理水平的
应用就有很多限制。不过总的来讲我觉得您这个发明还是很有前途的，好好优化推广一
下！
【在 P*******D 的大作中提到】
: 恩，我们正在做organelle specific的probe。目前作为global GSH的monitor没有问题
: ，也很方便。live animal，我估计zebrafish没问题, :)
: 如果是mice，就有荧光penetration的问题，我们也在想一些办法解决这个，但是确实
: 想做到animal上。
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C*********u
发帖数: 811 | 17 相当有用啊，redox status，oxidative stress很多领域都用得到！
【在 P*******D 的大作中提到】
: 请教一下大家，我们最近develop了一个能在live cell里面定量glutathione的
: fluorescent probe，大家有什么建议，可以回答什么important的biological
: questions？
: Invitrogen卖一个叫thioltracker violet的probe，但是这个不能定量，只能定性的看
: 一下GSH的变化。尽管GSH probe的文章都发烂了，也没有一个能在live cell里面定量
: 的。
: 我们develop了一个probe （ThiolQuant Green）可以很好的定量细胞里面的GSH (
: reduced form only)。我们把这个probe用于confocal microscope和flow cytometry，
: 能很好的和cell lysate GSH measurement correlate.
: 相比起来redox GFP or YFP，ThiolQuant Green是直接测量reduced form GSH，而不是
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P*******D
发帖数: 523 | 18 我们就是想把这个做到钙离子成像的水平，您提的毒性，反应速度，可逆性的问题，我
们现在基本都有sense，应该可以解决。顺路说一下，以前不知道Fura-2是Roger Tsien
develop的，就知道他的GFP，在膜拜一下。
一个关键问题是，Calcium signaling会有浓度的spike，不知道GSH浓度会不会有spike
的变化，或者局部spike的变化，有没有啥文献支持这种hypothesis
【在 s******y 的大作中提到】
: 这么说吧，潜在的应用前途太多了，多得我一下子不知道怎么说才好。这么说吧，这个
: 东西的用途和以前的钙离子成像的用途几乎一样重要。
: 细胞内的氧化/还原状态一向是一个非常重要的话题，尤其是整个生物领域往生理倾斜
: 的过程中，如何对氧化/还原状进行定量评估一直是个重要问题。现有的几个工具（比
: 方说那几个荧光蛋白）都有背景过高而且不准确的问题。你们做的probe如果能解决这
: 个问题的话会有大用处。
: 不过，这里有几个问题你们可能需要解决：
: 1。 对于细胞有无毒性？尤其是长期培养
: 2。 反应速度如何？
: 3。 可逆性够不够高？（这个会决定你们的定量线性程度）
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s******y
发帖数: 28562 | 19
Tsien
spike
hypoxia, mitochondria stress, etc., 应该都会导致局部的GSH变化。
如果要测试的话，用一些常见的mitochondria decoupler 即可
【在 P*******D 的大作中提到】
: 我们就是想把这个做到钙离子成像的水平，您提的毒性，反应速度，可逆性的问题，我
: 们现在基本都有sense，应该可以解决。顺路说一下，以前不知道Fura-2是Roger Tsien
: develop的，就知道他的GFP，在膜拜一下。
: 一个关键问题是，Calcium signaling会有浓度的spike，不知道GSH浓度会不会有spike
: 的变化，或者局部spike的变化，有没有啥文献支持这种hypothesis
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A******y
发帖数: 2041 | 20 Most people look at GSH depletion because the cells already have a lot of it
. Some cells if you treated them with high glutamate, it will block
cysteine uptakes and deplete its GSH level. Your probe has a Micheal's
acceptor, so I you will have toxicity around 10s microM, but it is probably
okay to do short term live cell imagining.
I wounder if you treated with certain compounds, would you be able to
determine specific GSH pool depletion because there is a cyto- and a mito-
pool of GSH.
Tsien
spike
【在 P*******D 的大作中提到】
: 我们就是想把这个做到钙离子成像的水平，您提的毒性，反应速度，可逆性的问题，我
: 们现在基本都有sense，应该可以解决。顺路说一下，以前不知道Fura-2是Roger Tsien
: develop的，就知道他的GFP，在膜拜一下。
: 一个关键问题是，Calcium signaling会有浓度的spike，不知道GSH浓度会不会有spike
: 的变化，或者局部spike的变化，有没有啥文献支持这种hypothesis
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P*******D
发帖数: 523 | 21 Thanks, ArtyArty! This probe does not have organelle specificity, as we
discussed in the paper. so we cannot distinguish between the cyto and mito
pools of GSH. this will certainly be our next step.
In terms of toxicity, we have not measured IC50 yet. during the 1-2 h
experiment, we did not observe any apparent toxicity. However, this does not
mean it does not have long term toxicity.
The highest probe concentration we used was 1 uM. For HeLa cells, we can use
the concentration as low as 20 nM. it is a little bit cell line dependent.
but the good thing is that the quantification is probe concentration
independent. The coumarin structure we used in fact pretty sucks. the
quantum yield is very low. so if we modify the structure, we could use low
nM probe for all cells, I believe.
thanks!
it
probably
【在 A******y 的大作中提到】
: Most people look at GSH depletion because the cells already have a lot of it
: . Some cells if you treated them with high glutamate, it will block
: cysteine uptakes and deplete its GSH level. Your probe has a Micheal's
: acceptor, so I you will have toxicity around 10s microM, but it is probably
: okay to do short term live cell imagining.
: I wounder if you treated with certain compounds, would you be able to
: determine specific GSH pool depletion because there is a cyto- and a mito-
: pool of GSH.
:
: Tsien
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A******y
发帖数: 2041 | 22 I think confocal microscopy with organelle specific dye (i.e. mito-tracker)
together with your probe will be able to tell if mitochondrial GHS is
depleted in mitochondria.
not
use
.
【在 P*******D 的大作中提到】
: Thanks, ArtyArty! This probe does not have organelle specificity, as we
: discussed in the paper. so we cannot distinguish between the cyto and mito
: pools of GSH. this will certainly be our next step.
: In terms of toxicity, we have not measured IC50 yet. during the 1-2 h
: experiment, we did not observe any apparent toxicity. However, this does not
: mean it does not have long term toxicity.
: The highest probe concentration we used was 1 uM. For HeLa cells, we can use
: the concentration as low as 20 nM. it is a little bit cell line dependent.
: but the good thing is that the quantification is probe concentration
: independent. The coumarin structure we used in fact pretty sucks. the
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