d****i
发帖数: 2346 | 1 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL. |
i**********a
发帖数: 1402 | 2 加热也不多。
【在 d****i 的大作中提到】
: 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
: 目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL.
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d****i
发帖数: 2346 | 3
不多是什么意思？
【在 i**********a 的大作中提到】
: 加热也不多。
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m***y
发帖数: 627 | 4 意思就是加热不加热关系都不大
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 不多是什么意思？
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j*****9
发帖数: 716 | |
d****i
发帖数: 2346 | |
s******y
发帖数: 28562 | 7 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘
【在 d****i 的大作中提到】
: 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
: 目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL.
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d****i
发帖数: 2346 | 8
DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。
【在 s******y 的大作中提到】
: 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘
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s******y
发帖数: 28562 | 9
是的，尿素加热会影响蛋白修饰。主要是有些修饰会产生化学反应。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。
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K******S
发帖数: 10109 | 10 don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and you will
be fine.
【在 d****i 的大作中提到】
:
: DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。
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f*******d
发帖数: 92 | 11 哦？那么heating之后DNA就沉淀了还是断了呢？
【在 s******y 的大作中提到】
: 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘
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d****i
发帖数: 2346 | 12 配尿素溶液时候说是不能超过37度，你这里说60是怎么回事？
[在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到：]
：don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and
you will be fine.
：
：........... |
r*****8
发帖数: 2560 | 13 有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
目的是把蛋白质变为单链。
跟尿素没关系。 |
d****i
发帖数: 2346 | 14 尿素不是可以变性吗？
[在 rabbit8 (兔子) 的大作中提到：]
：
：有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
：........... |
K******S
发帖数: 10109 | 15 Urea will cause carbamylation of protein/peptides which is usually related
to temperature and freshness of Urea. Rule of thumb is below 60 degree the
reaction is pretty slow. 37 is definitely too conservative.
【在 d****i 的大作中提到】
: 配尿素溶液时候说是不能超过37度，你这里说60是怎么回事？
: [在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到：]
: ：don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and
: you will be fine.
: ：
: ：...........
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v**********m
发帖数: 5516 | 16 顶。做蛋白修饰质谱分析的同修说得靠谱。
【在 K******S 的大作中提到】
: Urea will cause carbamylation of protein/peptides which is usually related
: to temperature and freshness of Urea. Rule of thumb is below 60 degree the
: reaction is pretty slow. 37 is definitely too conservative.
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d****i
发帖数: 2346 | 17 western做出来了，发现在我手里8M urea不能迅速灭活蛋白修饰酶，我需要的PTM都没
有，阳性对照也没有。正在找原因。 |
K******5
发帖数: 10 | 18 还用这么传统办法提蛋白？有spin column based kit。一两分钟搞定，几乎不会有大
genomic DNA，上胶前要加热的。
【在 d****i 的大作中提到】
: western做出来了，发现在我手里8M urea不能迅速灭活蛋白修饰酶，我需要的PTM都没
: 有，阳性对照也没有。正在找原因。
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d****i
发帖数: 2346 | 19
目的不是去除genomic DNA，是让蛋白迅速变性。
【在 K******5 的大作中提到】
: 还用这么传统办法提蛋白？有spin column based kit。一两分钟搞定，几乎不会有大
: genomic DNA，上胶前要加热的。
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i******1
发帖数: 21 | 20 这帖子还没沉？
这问题不清楚。到底要跑胶看啥？8M urea 不足以denature所有的protein，特别是好
多酶类，所以很多的modification你都看不到了, 比如phosphorylation,
ubiquitination等. 可以75C左右加热5~10分钟，有carbamylation 和其他
modification产生，但总量不到~5%，大部分protein还在。总之，具体问题具体分析。 |
