h*********y
发帖数: 79 | 1 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？ |
r******k
发帖数: 446 | 2 biotin!!!有些蛋白是瞬间结合 但是biotin的技术 可以让从前结合过的蛋白都标记上 |
C*********m
发帖数: 213 | 3 microscale thermophoresis, NMR
【在 h*********y 的大作中提到】
: 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
: 还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？
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e****s
发帖数: 1125 | 4 如果有精确的在平衡环境下的测定方法，Stoichiometry也就自然知道答案了。
不过，很多时候并不容易。不容的interactions和蛋白的性质都对检测方法有不容的要
求。
Light scattering,不同的荧光技术（FRET, BRET, Quenching, PF）
【在 h*********y 的大作中提到】
: 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
: 还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？
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y*********u
发帖数: 183 | 5 could you elaborate on it alittlebit? Thanks alot!!! I am very interested in
it.
【在 r******k 的大作中提到】
: biotin!!!有些蛋白是瞬间结合 但是biotin的技术 可以让从前结合过的蛋白都标记上
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e****s
发帖数: 1125 | 6 我没用过，了解一点点。
我猜他指的是基于Crosslinking的Lable transfer方法。你Google一下就能找到。这个
方法并不能回答LZ的Stoichiometric ratio的问题。可能，细胞里测PPI有些优势。
in
【在 y*********u 的大作中提到】
: could you elaborate on it alittlebit? Thanks alot!!! I am very interested in
: it.
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D***a
发帖数: 516 | |
L*******s
发帖数: 59 | 8 ETH有个人专门做蛋白组的，可以分离protein complexes，这个或许相关
【在 h*********y 的大作中提到】
: 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
: 还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？
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b******y
发帖数: 627 | 9 If A isn't far smaller than B and their bindings, no matter how many, are
strong, you can do size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light
scattering (SEC-MALS). If the complex behaves well, you can get precise
molecular weight of it. As such, it isn't too hard to figure out the
stoichiometry of A versus B.
【在 h*********y 的大作中提到】
: 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
: 还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？
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h*********y
发帖数: 79 | 10 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
(1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
(2). microscale thermophoresis
没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
牛人帮我介绍一下？
(3). NMR
蛋白分子量太大。。。
(4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
-MALS)
从本人实验来看，蛋白A为10KD，配体B蛋白120KD，该方法测定的分子量精度不足以区
分120KD上添加了几个10KD。
(5). 不同的荧光技术（FRET, BRET, Quenching, PF）
如(4)，不知道如何定量。
(6).ETH有个人专门做蛋白组的，可以分离protein complexes，这个或许相关
分离不成问题，关键是定分子量。。。
除了以上建议，另外有朋友建议用Beckman 分析定量超速离心机 Beckman optima XL-A
来定分子量，不知这个可行不？
【在 h*********y 的大作中提到】
: 如果要测定几个A蛋白能同时结合到B蛋白，除了传统的ITC和SPR之外，
: 还有没有什么灵敏的技术大家帮忙推荐？
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e****s
发帖数: 1125 | 11 把我前面说的再重复一遍，任何涉及分离的方法都不能用来定A:B间的结合比例，gel
filtration, ultracentrifuge, 等等。
你这个蛋白大小，最可行和简单的方法就是PF或叫Anistropy。 因为一个蛋白才10K,
另一个够大。PF会很合适。
SEC
【在 h*********y 的大作中提到】
: 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
: (1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
: 感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
: (2). microscale thermophoresis
: 没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
: 牛人帮我介绍一下？
: (3). NMR
: 蛋白分子量太大。。。
: (4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
: -MALS)
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b******y
发帖数: 627 | 12 Again, if A binds B strong, you can try native PAGE with increasing amount A
from zero to whatever maximum, the resolution of native gel might be
sufficient for you to distinguish B/Ai from B/A(i-1). If indeed, you will
get n+1 band on the native PAGE when combining all lanes: B, BA1, ... BAi,..
.. BAn.
Single molecule quenching might work as well. Label A with GFP with near 100
% efficiency with little quenching already. Establish complex B(A-GFP)n on
cover slide using TIRF. Do single molecule quenching. Count how many
quenching events per molecule. Do a histogram. The highest major value is
your n.
Good luck! Neither is easy.
SEC
【在 h*********y 的大作中提到】
: 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
: (1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
: 感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
: (2). microscale thermophoresis
: 没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
: 牛人帮我介绍一下？
: (3). NMR
: 蛋白分子量太大。。。
: (4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
: -MALS)
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o*****e
发帖数: 189 | 13 alpha screen? 需要特定的仪器读结果。 |
