O**********a
发帖数: 317 | 1 细胞要从老鼠里面分出来，耗时很久；然后digest、FACS分选，最后到裂解细胞；要把
细胞折磨4－5h。
这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧？ |
O**********a
发帖数: 317 | |
f******g
发帖数: 1003 | 3 肯定有影响，但是不可避免吧。只能尽快加快速度，别离开冰 |
s******y
发帖数: 28562 | 4 不能用那些RNA 保存试剂先处理一下细胞么？
【在 O**********a 的大作中提到】
: 细胞要从老鼠里面分出来，耗时很久；然后digest、FACS分选，最后到裂解细胞；要把
: 细胞折磨4－5h。
: 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧？
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a*******g
发帖数: 33 | 5 我听到的 一个 说法是在冰上，细胞的基因表达不大，估计也没人验证过。激光切割的
缺点也很明显。你提到的方法应该是目前主流的办法。 |
O**********a
发帖数: 317 | 6 就是从杀老鼠分离tissue到酶解，再到FACS获得细胞，最后能裂解细胞，动作快也需要
3-4h。
你说的RNA保存试剂是什么？
【在 s******y 的大作中提到】
: 不能用那些RNA 保存试剂先处理一下细胞么？
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h****6
发帖数: 229 | 7 能不能先固定，再裂解？
：就是从杀老鼠分离tissue到酶解，再到FACS获得细胞，最后能裂解细胞，动作快也需
要3-4h。
：你说的RNA保存试剂是什么？ |
s******y
发帖数: 28562 | 8 Such as RNAlater, DNA/RNA Shield, etc.?
【在 O**********a 的大作中提到】
: 就是从杀老鼠分离tissue到酶解，再到FACS获得细胞，最后能裂解细胞，动作快也需要
: 3-4h。
: 你说的RNA保存试剂是什么？
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n******7
发帖数: 12463 | |
l***y
发帖数: 638 | 10 放冰上几小时还好都是这么做的，但是要facs要处理就不好说了
得看要做的是什么，有个control做横向比较的话可能问题不大，比如说比较wt和mut老
鼠里同一种细胞，处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥表
达啥不表达，这个得想其他办法好好validate的 |
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O**********a
发帖数: 317 | 11 哎，我就是后者啊，sort出来看表达谱，没有KO对照。
怎么横向比较啊？同时测sort出来的negative细胞？感觉还是不行啊。
[在 liphy (liphy) 的大作中提到：]
：放冰上几小时还好都是这么做的，但是要facs要处理就不好说了
：得看要做的是什么，有个control做横向比较的话可能问题不大，比如说比较wt和mut
老鼠里同一种细胞，处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥
表达啥不表达，这个得想其他办法好好validate的
：........... |
r*m
发帖数: 16380 | 12 组织切出来后直接扔进液氮，然后加buffer RLT homogenize。。。
要sorting的话，那个过程无论如何对基因表达有影响，测到的是细胞在sorting这种非
自然的环境下的stress response。。。 |
k***a
发帖数: 636 | 13 大家都说有影响，但有不得不这么做，于是都假设没有影响了。。 |
y****i
发帖数: 2194 | 14 所有Buffer里面加 actinomycin
【在 O**********a 的大作中提到】
: 细胞要从老鼠里面分出来，耗时很久；然后digest、FACS分选，最后到裂解细胞；要把
: 细胞折磨4－5h。
: 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧？
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l***y
发帖数: 638 | 15 neg的没什么用也得做，看看能不能去掉点处理产生的表达变化
重点是有没有想过表达谱里想看的是什么基因，有没有好的下游验证的手段
只是瞎蒙的话又不差钱的就先做了再说吧，再多想也是纸上谈兵
mut
【在 O**********a 的大作中提到】
: 哎，我就是后者啊，sort出来看表达谱，没有KO对照。
: 怎么横向比较啊？同时测sort出来的negative细胞？感觉还是不行啊。
: [在 liphy (liphy) 的大作中提到：]
: ：放冰上几小时还好都是这么做的，但是要facs要处理就不好说了
: ：得看要做的是什么，有个control做横向比较的话可能问题不大，比如说比较wt和mut
: 老鼠里同一种细胞，处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥
: 表达啥不表达，这个得想其他办法好好validate的
: ：...........
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t******5
发帖数: 67 | 16 这个是真有影响的，如果看ribosome的谱在处理前与后明显有差别，但大家都默认这种
差别影响不大，可变的方法是有人用0.1% formaldehyde固定后再处理
【在 O**********a 的大作中提到】
: 细胞要从老鼠里面分出来，耗时很久；然后digest、FACS分选，最后到裂解细胞；要把
: 细胞折磨4－5h。
: 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧？
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i**o
发帖数: 76 | |
