O**********a 发帖数: 317 | 1 细胞要从老鼠里面分出来,耗时很久;然后digest、FACS分选,最后到裂解细胞;要把
细胞折磨4-5h。
这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧? |
O**********a 发帖数: 317 | |
f******g 发帖数: 1003 | 3 肯定有影响,但是不可避免吧。只能尽快加快速度,别离开冰 |
s******y 发帖数: 28562 | 4 不能用那些RNA 保存试剂先处理一下细胞么?
【在 O**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 细胞要从老鼠里面分出来,耗时很久;然后digest、FACS分选,最后到裂解细胞;要把 : 细胞折磨4-5h。 : 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧?
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a*******g 发帖数: 33 | 5 我听到的 一个 说法是在冰上,细胞的基因表达不大,估计也没人验证过。激光切割的
缺点也很明显。你提到的方法应该是目前主流的办法。 |
O**********a 发帖数: 317 | 6 就是从杀老鼠分离tissue到酶解,再到FACS获得细胞,最后能裂解细胞,动作快也需要
3-4h。
你说的RNA保存试剂是什么?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不能用那些RNA 保存试剂先处理一下细胞么?
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h****6 发帖数: 229 | 7 能不能先固定,再裂解?
:就是从杀老鼠分离tissue到酶解,再到FACS获得细胞,最后能裂解细胞,动作快也需
要3-4h。
:你说的RNA保存试剂是什么? |
s******y 发帖数: 28562 | 8 Such as RNAlater, DNA/RNA Shield, etc.?
【在 O**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是从杀老鼠分离tissue到酶解,再到FACS获得细胞,最后能裂解细胞,动作快也需要 : 3-4h。 : 你说的RNA保存试剂是什么?
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n******7 发帖数: 12463 | |
l***y 发帖数: 638 | 10 放冰上几小时还好都是这么做的,但是要facs要处理就不好说了
得看要做的是什么,有个control做横向比较的话可能问题不大,比如说比较wt和mut老
鼠里同一种细胞,处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥表
达啥不表达,这个得想其他办法好好validate的 |
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O**********a 发帖数: 317 | 11 哎,我就是后者啊,sort出来看表达谱,没有KO对照。
怎么横向比较啊?同时测sort出来的negative细胞?感觉还是不行啊。
[在 liphy (liphy) 的大作中提到:]
:放冰上几小时还好都是这么做的,但是要facs要处理就不好说了
:得看要做的是什么,有个control做横向比较的话可能问题不大,比如说比较wt和mut
老鼠里同一种细胞,处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥
表达啥不表达,这个得想其他办法好好validate的
:........... |
r*m 发帖数: 16380 | 12 组织切出来后直接扔进液氮,然后加buffer RLT homogenize。。。
要sorting的话,那个过程无论如何对基因表达有影响,测到的是细胞在sorting这种非
自然的环境下的stress response。。。 |
k***a 发帖数: 636 | 13 大家都说有影响,但有不得不这么做,于是都假设没有影响了。。 |
y****i 发帖数: 2194 | 14 所有Buffer里面加 actinomycin
【在 O**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 细胞要从老鼠里面分出来,耗时很久;然后digest、FACS分选,最后到裂解细胞;要把 : 细胞折磨4-5h。 : 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧?
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l***y 发帖数: 638 | 15 neg的没什么用也得做,看看能不能去掉点处理产生的表达变化
重点是有没有想过表达谱里想看的是什么基因,有没有好的下游验证的手段
只是瞎蒙的话又不差钱的就先做了再说吧,再多想也是纸上谈兵
mut
【在 O**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 哎,我就是后者啊,sort出来看表达谱,没有KO对照。 : 怎么横向比较啊?同时测sort出来的negative细胞?感觉还是不行啊。 : [在 liphy (liphy) 的大作中提到:] : :放冰上几小时还好都是这么做的,但是要facs要处理就不好说了 : :得看要做的是什么,有个control做横向比较的话可能问题不大,比如说比较wt和mut : 老鼠里同一种细胞,处理过程一样的话应该可以。如果就是把某种细胞sort出来看看啥 : 表达啥不表达,这个得想其他办法好好validate的 : :...........
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t******5 发帖数: 67 | 16 这个是真有影响的,如果看ribosome的谱在处理前与后明显有差别,但大家都默认这种
差别影响不大,可变的方法是有人用0.1% formaldehyde固定后再处理
【在 O**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 细胞要从老鼠里面分出来,耗时很久;然后digest、FACS分选,最后到裂解细胞;要把 : 细胞折磨4-5h。 : 这个过程mRNA表达谱会有比较大的变动吧?
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i**o 发帖数: 76 | |