c********y 发帖数: 22 | 1 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有
基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
求帮分析原因。。。 |
T*****e 发帖数: 247 | 2 模板有问题吗?模板质量,模板浓度都会影响,可能你要稀释模板试试
引物GC含量多少?三对不同引物差别是什么?同一对引物你blast了吗? |
i**********a 发帖数: 1402 | 3 genomic dna pcr的时候浓度不能太高,多稀释一下,引物3'端以g或c结尾。我做一般
用kod酶,现在谁还用taq。
【在 c********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助 : 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这 : 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有 : 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。 : 求帮分析原因。。。
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M******g 发帖数: 152 | 4 Use Q5 from NEB.
or try to purify your genomic DNA and then do PCR again. |
c********y 发帖数: 22 | 5 模版每个体系加40ug,刚开始我确实加太多了,在1kb那里有条带就以为是目的条带,
还一本正经割胶回收连接,后来才意识到可能是基因组dna而已,现在gapdh扩得很好
引物gc含量基本都在50-60之间我觉得可以接受吧,引物blast过,都有15个碱基错配,
可是我的目的片段就那么长,能设计的都设计了,再设计就不是那块区域了
【在 T*****e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 模板有问题吗?模板质量,模板浓度都会影响,可能你要稀释模板试试 : 引物GC含量多少?三对不同引物差别是什么?同一对引物你blast了吗?
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c********y 发帖数: 22 | 6 以前我也用kod,后来觉得taq扩增效率高,先把条件摸出来再换高保真,现在新到的实
验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
得有用。。。
现在模版稀释了,40ng一个体系,引物3‘端也都是g或者c
【在 i**********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : genomic dna pcr的时候浓度不能太高,多稀释一下,引物3'端以g或c结尾。我做一般 : 用kod酶,现在谁还用taq。
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c********y 发帖数: 22 | 7 dna重新提过了,用试剂盒提的,感觉应该还好吧,gapdh扩得挺好的。
我试试,不停重新定酶怕老板批啊。。。
【在 M******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Use Q5 from NEB. : or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.
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j****n 发帖数: 3370 | 8 不同的酶最优条件是不一样的。。。
我们做pcr优化顺序
1 touch down pcr
2 gradient pcr
3 换buffer 推荐epicenter buffer kit 有12 种不同buffer 适合不同gc含量的
对于特别难P的 我们经常发现只有1-2个buffer可行
4 换酶 我们实验室全部都是用q5 除了colony pcr 所以一般换酶不会有太好结果 以前
也试过不同公司的 感觉都不如q5
【在 c********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 以前我也用kod,后来觉得taq扩增效率高,先把条件摸出来再换高保真,现在新到的实 : 验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见 : 得有用。。。 : 现在模版稀释了,40ng一个体系,引物3‘端也都是g或者c
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T*****e 发帖数: 247 | 9 我建议你用q5,如果你有的话。
模板我建议你同时用1倍,10倍稀释,100倍稀释,1000倍稀释同时做。
你说的15个错配是什么情况?一共多长?怎么会这样?如果你引物设计有困难,建议用
巢式PCR
麻烦一点的就是设计个2~3kb好扩增的,然后做成plasmid,再从里面扩增你要的1kb,
应该容易很多
退货温度也可以优化一下,不过如果是Q5,我都用NEB Tm calculator
记得NEB有个high GC的buffer 不过我从来没有遇到过那样的问题 |
n**u 发帖数: 87 | 10 1kb 左右? 合成吧 也就五天就合好了
:要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
:引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这 |
s******s 发帖数: 13035 | 11 debug 的话,我一般都属先gradient pcr, 不行的话nested 基本能搞定。可能要换一
两个酶试试。
不过就一k,还不如合成,或者买clone从plasmid里面p
【在 c********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助 : 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这 : 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有 : 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。 : 求帮分析原因。。。
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l********e 发帖数: 415 | 12 问得太笼统。直接把你的序列都放出来,别人才有可能帮你。
否则都是扯淡。
【在 c********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助 : 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这 : 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有 : 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。 : 求帮分析原因。。。
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