D***a
发帖数: 516 | 1 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
粒序列没问题。
为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 puro和你的gene是2A在一起的，还是独立的
【在 D***a 的大作中提到】
: 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
: 里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
: 染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
: 的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
: 粒序列没问题。
: 为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。
|
D***a
发帖数: 516 | |
D***a
发帖数: 516 | 4 我用过别的lentiviral vector过表达GFP和其他蛋白，没有selection marker，但我能
得到细胞几乎100%阳性。我认为我做病毒的方法是没问题的。 |
j******i
发帖数: 939 | 5 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话 在293T细胞里会得到大量的不完整的
viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的
stable
【在 D***a 的大作中提到】
: 独立的吧，我用的是这个载体
: http://www.addgene.org/39481/
: 在网上找到有人和我遇到一样的问题：
: https://www.researchgate.net/post/What_to_do_with_a_false_positive_in_stable
: _cell_select
|
D***a
发帖数: 516 | 6 谢谢。 我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了？会
产生这种问题吗？
【在 j******i 的大作中提到】
: 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话 在293T细胞里会得到大量的不完整的
: viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的
:
: stable
|
D***a
发帖数: 516 | 7 另外，我突发奇想，可不可以在hela细胞转染lentiviral载体和表达integrase的质粒
，是不是也能整合到基因组里面去？ |
j******i
发帖数: 939 | 8 如果只有coding sequence的话 应该用2A或者IRES链接puro 否则的话 目的基因可能和
puro相互影响
【在 D***a 的大作中提到】
: 谢谢。 我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了？会
: 产生这种问题吗？
|
D***a
发帖数: 516 | 9 我用的是这个载体，能帮我看一下吗？加在bamHI和XhoI之间
http://www.addgene.org/39481/
【在 j******i 的大作中提到】
: 如果只有coding sequence的话 应该用2A或者IRES链接puro 否则的话 目的基因可能和
: puro相互影响
|
h***e
发帖数: 7320 | |
|
|
j******i
发帖数: 939 | 11 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元
件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
【在 D***a 的大作中提到】
: 我用的是这个载体，能帮我看一下吗？加在bamHI和XhoI之间
: http://www.addgene.org/39481/
|
D***a
发帖数: 516 | 12 太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗？
【在 j******i 的大作中提到】
: 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元
: 件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
|
j******i
发帖数: 939 | 13 Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。
【在 D***a 的大作中提到】
: 太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗？
|
D***a
发帖数: 516 | 14 太感谢了。手里有这个质粒。
【在 j******i 的大作中提到】
: Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
: 把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。
|
D***a
发帖数: 516 | 15 再问一个，是不是要把我的基因的stop codon去掉？
【在 j******i 的大作中提到】
: Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
: 把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。
|
j******i
发帖数: 939 | 16 是的
【在 D***a 的大作中提到】
: 再问一个，是不是要把我的基因的stop codon去掉？
|
j****x
发帖数: 1704 | 17 "两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达"这个问题不大，有些很成熟的商用载体也
是这么干的。我以前做过几个细胞系，不同的基因都表达的很正常。
慢病毒载体插入5kb的片段，包装效率很可能会比包装1kb以下的差出2个数量级以上。
但考虑到小基因的表达也很弱，应该是载体本身有存在系统系的问题，WPRE元件缺失应
该是可能性之一。只是好奇，设计载体的人居然连这点都没考虑到。
【在 j******i 的大作中提到】
: 这个载体本身的设计非常糟糕 能不用的话就不要用了 我看了一下 首先是缺了WPRE元
: 件 再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰
|
