l*******k
发帖数: 63 | 1 大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF
file以后倒入MassMatrix这个软件做二硫键的search。结果做出来非常的不理想，
duplicate之间几乎没有任何match。虽然说二硫键本身很dynamic而且质谱也是有一定
误差的，但是打出来几十个二硫键但是几乎没有match这种情况还是太让人沮丧了。我
对我自己的实验操作还是非常自信的。请有经验的各位高手介绍下经验呗，谢谢^_^ |
a******c
发帖数: 597 | 2 这个你可能需要用人工用眼睛看m/z的峰图。
搜库可能不管用。
【在 l*******k 的大作中提到】
: 大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
: 白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF
: file以后倒入MassMatrix这个软件做二硫键的search。结果做出来非常的不理想，
: duplicate之间几乎没有任何match。虽然说二硫键本身很dynamic而且质谱也是有一定
: 误差的，但是打出来几十个二硫键但是几乎没有match这种情况还是太让人沮丧了。我
: 对我自己的实验操作还是非常自信的。请有经验的各位高手介绍下经验呗，谢谢^_^
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p*********3
发帖数: 44 | 3 如果形成二硫键的两条支链中有一条比较短，比如五个氨基酸，可以将二硫键加上这条
支链的质量看成在另一条支链上的半胱氨酸的PTM，再用一些软件去搜索，我用的是
PEAKS7.5.还有一些专门搜索带交联的肽段的质谱分析软件，比如xQuest/xProphet和
pFind studio，我没有用过，不好评论。
【在 l*******k 的大作中提到】
: 大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
: 白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF
: file以后倒入MassMatrix这个软件做二硫键的search。结果做出来非常的不理想，
: duplicate之间几乎没有任何match。虽然说二硫键本身很dynamic而且质谱也是有一定
: 误差的，但是打出来几十个二硫键但是几乎没有match这种情况还是太让人沮丧了。我
: 对我自己的实验操作还是非常自信的。请有经验的各位高手介绍下经验呗，谢谢^_^
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K******S
发帖数: 10109 | 4 这是经典的质朴实验，第一步先用一种试剂alkylate free cys. 第二步用 dtt打断二
硫键，第三步用另外一种试剂 alkylate 形成二硫键的 cys. 这样哪些 cys 是 free
的 哪些是二硫键的就一目了然了。因为两种 alkylation 试剂修饰后的 cys 分子量不
一样。和用什么质朴，用什么软件没有太大关系。
：大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
：白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF |
p*********3
发帖数: 44 | 5 但有多个二硫键时如何确定半胱氨酸之间是怎么配对的呢？
的蛋
MGF
【在 K******S 的大作中提到】
: 这是经典的质朴实验，第一步先用一种试剂alkylate free cys. 第二步用 dtt打断二
: 硫键，第三步用另外一种试剂 alkylate 形成二硫键的 cys. 这样哪些 cys 是 free
: 的 哪些是二硫键的就一目了然了。因为两种 alkylation 试剂修饰后的 cys 分子量不
: 一样。和用什么质朴，用什么软件没有太大关系。
:
: ：大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
: ：白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF
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K******S
发帖数: 10109 | 6 看蛋白的序列和所选择酶的切点,这就是case by case了。
比较dtt处理前和处理后的肽段，目前没有什么软件能有效的把二硫键连接的2个肽段找
出来的。所以有二硫键的时候大部分软件都会缺失那部分序列，但去掉二硫键后会检测
到那些序列。
：但有多个二硫键时如何确定半胱氨酸之间是怎么配对的呢？
：【 在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到: 】 |
s********d
发帖数: 47 | 7 你前期处理注意disulfide bond shuffeling这个问题了吗？
我做过很多用质谱定位二硫键的实验。发现最大的问题是disulfide bond shuffeling.
解谱用软件就好了，再加手工判断一下谱图的质量。有成熟的软件可分析。如果有兴趣
，给我留言或者发邮件吧。 |
A******o
发帖数: 143 | 8 用pep finder 软件不难做的。软件可以试用2个月
Disulfide bond shuffling 是常见 |
l*******k
发帖数: 63 | 9 谢谢您的回复，这倒是个办法。可惜我上周几乎去manually查了所有的MS1，发现有一
组condition的duplicate可以找到相同的MS1，但是很多在两组中同时出现的peptide
sequence没有同时被选择去打MS2。但是另外一组condition比较奇怪，MS1都几乎找不
到相同的，我都不知道怎么弄了。我估摸着干脆直接再做一组实验好了，不要过于纠结
这些小问题。您的意见呢？谢谢
【在 p*********3 的大作中提到】
: 如果形成二硫键的两条支链中有一条比较短，比如五个氨基酸，可以将二硫键加上这条
: 支链的质量看成在另一条支链上的半胱氨酸的PTM，再用一些软件去搜索，我用的是
: PEAKS7.5.还有一些专门搜索带交联的肽段的质谱分析软件，比如xQuest/xProphet和
: pFind studio，我没有用过，不好评论。
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l*******k
发帖数: 63 | 10 谢谢您的建议！其实我们还设计了一组实验，就是用NEM先block thiols再用CysTMT来
做label，这组实验我们是打算作为一种“indirect”验证方法的，因为我这个蛋白有
两个subunit，一共好几十个Cys，如果用手工的方法来找，真心太麻烦了，现在有不少
检查二硫键的软件可以使用，但是其accuracy和precision还真的有些难说。
的蛋
MGF
【在 K******S 的大作中提到】
: 这是经典的质朴实验，第一步先用一种试剂alkylate free cys. 第二步用 dtt打断二
: 硫键，第三步用另外一种试剂 alkylate 形成二硫键的 cys. 这样哪些 cys 是 free
: 的 哪些是二硫键的就一目了然了。因为两种 alkylation 试剂修饰后的 cys 分子量不
: 一样。和用什么质朴，用什么软件没有太大关系。
:
: ：大家好，我现在做基于质谱方法的二硫键的鉴定。我的实验是在一个recombinant的蛋
: ：白基础上做三组condition，每个condition做duplicate。质谱打出来的结果做成MGF
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l*******k
发帖数: 63 | 11 我们是考虑到二硫键scramble这个问题，但是因为做in gel digest，也没有特别好的
办法，正常的PAGE 胶还是照样跑，我只是把所有的反应条件从pH 8 改成了pH 7.0 从
而尝试着减少二硫键重组。我上周去查了MS1，发现有一组condition中的duplicate都
有match的MS1，但是很多MS1都仅仅在其中一组被选中去打MS2而没有再另外一组中打
MS2。但是另外一组比较奇怪的是duplicate中几乎没有什么相同的MS1，这是让我很费
解的一件事情。请您介绍下您的经验好吗？包括二硫键shuffle和打质谱的经验。谢谢！
shuffeling.
【在 s********d 的大作中提到】
: 你前期处理注意disulfide bond shuffeling这个问题了吗？
: 我做过很多用质谱定位二硫键的实验。发现最大的问题是disulfide bond shuffeling.
: 解谱用软件就好了，再加手工判断一下谱图的质量。有成熟的软件可分析。如果有兴趣
: ，给我留言或者发邮件吧。
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l*******k
发帖数: 63 | 12 谢谢。我除了用软件，也会manually check，但是因为我的蛋白有2个subunit，加起来
一共好几十个二硫键，再加上楼下说的二硫键shuffle的问题，如果只是手工的话，我
真的会疯掉的。。。
【在 a******c 的大作中提到】
: 这个你可能需要用人工用眼睛看m/z的峰图。
: 搜库可能不管用。
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w*****g
发帖数: 125 | 13 MS2最好用ETD，适合于大的肽段，而且碎片离子信息多。
【在 l*******k 的大作中提到】
: 谢谢。我除了用软件，也会manually check，但是因为我的蛋白有2个subunit，加起来
: 一共好几十个二硫键，再加上楼下说的二硫键shuffle的问题，如果只是手工的话，我
: 真的会疯掉的。。。
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s********d
发帖数: 47 | 14 我感觉HCD比较好，谱图更清晰。ETD碎片太多 |
