m******g
发帖数: 69 | 1 ELISA假阳性太高了。western blot唯一的好处就是那个SDS-PAGE步骤。把蛋白按按照
质量分离了，从而部分消除了抗体非特异性可能造成的假阳性。可是ELISA只能是测定
抗体抗原结合程度，但是抗体是否特异性结合抗原，无法得知。但是ELISA如果做好了
，比WB好敏感多了，可以做error bar，也可以做到pg水平。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 2 I thought the ability for western blot to tell the difference has to do with
the linearity of the signal and maximum signal to noise ratio. If you use
film, you are limited by the film's linearity range which I "heard" is
between 2-10, so you need at least two fold differences to see a different.
Using a digital imager, some claim to have x2000 to x1000 fold linear range
especially if you are using fluorescent probes.
ELSA has high false rates that's why alpha-scan is developed. |
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A******y
发帖数: 2041 | 3 I thought the ability for western blot to tell the difference has to do with
the linearity of the signal and maximum signal to noise ratio. If you use
film, you are limited by the film's linearity range which I "heard" is
between 2-10, so you need at least two fold differences to see a different.
Using a digital imager, some claim to have x2000 to x1000 fold linear range
especially if you are using fluorescent probes.
ELSA has high false rates that's why alpha-scan is developed. |
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c****9
发帖数: 95 | 4 因为周末加假期，western blot做到最后没有暗室钥匙去完成最后一步。现将洗过的膜
放在WASHING BUFFER里面存在4度的冰箱里面，请问这能最多保存几天呢？是否会影响
最后的显影呢？谢谢各位解答。急。 |
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R****t
发帖数: 6 | 5 我以前做JNK Blot的时候 也遇过这种情况 估计是不同的isoforms |
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c**a
发帖数: 94 | 6 那为什么有些sample有,有些sample里没有呢. 而且blot for total JNK的时候就没有
那条带 |
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n**8
发帖数: 221 | 7 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
用的是RIPA buffer：
150 mM NaCl
1% NP40
0.5% of Sodium Deoxycholate
0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
50 mM Tris
请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
需不需要超声？
不甚感激！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 似乎如果上样量少的话，western blot中特异性强的band能被commasie blue染上，想
过去似乎是合理的，因为在有band的位置富集了抗体
不过从另一方面来说，是不是可以利用这一点使得band cutting以及之后的质谱变容易
呢？ |
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i******k
发帖数: 4625 | 9 blot过后的PVDF膜再用Coomassie blue染是完全可以的。如果染液新鲜，1-2分钟就够
了，马上脱色2-3次，每次不超过5分钟。这样染出来，条带清晰，背景干净。如果染的
时间过长，那背景就很难洗掉，而且脱色时间长的话，蛋白条带也会逐渐掉色变浅
至于试图染出lysate中特异条带，而这个蛋白不是特别富集的话，没有用的，因为这和
直接染胶没有什么区别 |
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n***w
发帖数: 2405 | 10 版上有人用过哪家的pdgfr beta的做过western blot?
谢谢！！！ |
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t******x
发帖数: 89 | 11 你们都用什么软件来定量统计Western Blot Band Density？ 可以的话，麻烦分享一下
，或者告诉我在哪里可以下载？
先谢谢了！ |
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s*****g
发帖数: 87 | 12 最近要检测一个蛋白的表达量，但是这个蛋白在细胞内的表达量很低
请教各位达人，以下哪个方法更灵敏，或者说更有可能检测到蛋白的表达？
1. Flow cytometry after treatment of FITC-conjugated primary antibody.
2. Western blot analysis using primary antibody and HRP-conjugated secondary
antibody
谢谢！ |
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l****j
发帖数: 70 | 13 有做过ApoB的western blot吗？512 KDa size
我怎么转不上呢？用的wet transfer,100V 60min,2h 都没出来
transfer buffer：25 mM tris,192 mM glycin, 0.1% SDS |
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c********u
发帖数: 250 | 14 transgenic mouse southern blot, 做了几个星期了还没出来,首要的问题如图，坑爹
的genomic DNA 用HindIII切了24个小时，60v 跑了6个小时，就给我跑成这副鬼样子，
大家提DNA， 溶DNA，切，跑胶有什么trick没？ 还有一个问题是，我的目标条带有
10kb，DIG probe, 我老板说10kb太大了，2-5kb最好，那我这种情况有可能成不？
真心求教，酌情发包子，谢谢。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 15 这个是明显的酶切没有切开阿。DNA不干净应该是根本问题。 southern blot不是什么
很复杂的试验，一般只要DNA是好的，都能出结果。 |
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r******t
发帖数: 135 | 16 请问是否有应用Western Blot Imaging System的同学？我们目前有一台旧的Storm，因
为取消应用X-片，所以要买一台WB的成像仪，希望效果接近X-片,请各位大牛讲一讲你
们都用什么。
多谢帮助。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 17 Almost all the modern western blot imaging system is better than films (
assuming you are using femto level substrate), I like the top of the line
alpha-innotech imager (do not get the red or blue one they try to sell; they
are horrible in my opinion). Bio-rad imager is very common but I think
their tech is the oldest. GE one is very nice. Do not get Kodak one if it
is still on the market (horrible).
Bio-rad recently join the ECL reagent market, their femto-ECL (Clarity) is a
lot cheaper than... 阅读全帖 |
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r******t
发帖数: 135 | 19 请问是否有应用Western Blot Imaging System的同学？我们目前有一台旧的Storm，因
为取消应用X-片，所以要买一台WB的成像仪，希望效果接近X-片,请各位大牛讲一讲你
们都用什么。
多谢帮助。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 20 Almost all the modern western blot imaging system is better than films (
assuming you are using femto level substrate), I like the top of the line
alpha-innotech imager (do not get the red or blue one they try to sell; they
are horrible in my opinion). Bio-rad imager is very common but I think
their tech is the oldest. GE one is very nice. Do not get Kodak one if it
is still on the market (horrible).
Bio-rad recently join the ECL reagent market, their femto-ECL (Clarity) is a
lot cheaper than... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 22 有人用过吗？现在想建一套HTP的western blotting，不知道Protein Simple这套系统
如何？ |
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v****y
发帖数: 9 | 23 弱弱滴问个技术问题，关于western blot, 我用anti-FLAG去检测 FLAG tagged的两种
蛋白，一个10kDa, 一个100KDa. 假设两种蛋白的表达量相等，也就是说两种蛋白的TAG
的数量是一样的。这种情况下， 在同一张膜上，我得到的两种蛋白的条带强度是一样
的吗？还是分子量大的蛋白的条带信号强度大？ |
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a**********2
发帖数: 28 | 24 转行新人，跑来向牛人们请教一下~
我最近要做一个semi-quantitative western blot
Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
用GAPDH来normalization
于是，会有两种不同的antibody，一种测我的target，另一种stain GAPDH.
在网上查了一晚上，还是搞不清哪种方式更好:
1）strip之后在同一张上stain；
2) 跑两张同样的膜分别stain；
如果1)效果好些，有什么strip buffer推荐吗？
如果2)好些，有什么需要特别注意事项？比如转膜时如何保证效率基本一致？
另外，综合而言，为了确保最终结果的有效性，除了对loading sample做个gradient之
外，还有什么其它建议吗？
完全转行新人，问题很弱，还请大家不要鄙视俺。。。
拜谢！ |
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f*c
发帖数: 2726 | 25 没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
谢谢 |
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B*H
发帖数: 2158 | 26 楼主，你就不能不跑胶，先做个DOT BLOT看看是不是抗体的问题。ACTIVMOTIF也有好多
HISTONE的抗体可以试试。我用他们家H3的挺好的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 把样品狠狠地vortex 了几次
RE: 到底是哪个起了作用也不知道
发信人: dahuzi (huhuhu), 信区: Biology
标 题: Re: histone western blot 求教
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 19 10:06:12 2013, 美东)
我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。bla bla ba |
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l****b
发帖数: 400 | 28 It is difficult to remove the fat, but not impossible. Spin first, then use
gentle vacuum to remove the top layer, which contains mostly lipids. Repeat
the process if necessary. The remaining lysates can be further diluted to
reduce the lipid concentration. Since liver samples generally have plenty of
proteins so diluting them would be OK. It is a pain in the neck but with
this method my liver western blots, even with samples from high fat fed mice
, look perfectly fine. |
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C*********r
发帖数: 4 | 29 实验室想买一imager, 主要用来扫描照相western blot化学发光 。 要求灵敏度和胶片
相当或高于，预算在2万内最好。考虑Bio-Rad 的chemidoc 和FujiFilm 的 LAS500,
LAS4000mini.实验室友人以前用过LAS3000， 很赞， 但是没有人用过Bio-Rad。各位用
过类似imager的朋友请谈谈并推荐推荐。 谢谢先. |
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g*****n
发帖数: 241 | 30 大家做western blot的stripping buffer是什么啊？
我以前用过的home-made的buffer有BME，味道太重了。有没有不需要BME的配方？
或者推荐一个便宜的公司产品。
谢谢 |
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g*****n
发帖数: 241 | 31 大家做western blot的stripping buffer是什么啊？
我以前用过的home-made的buffer有BME，味道太重了。有没有不需要BME的配方？
或者推荐一个便宜的公司产品。
谢谢 |
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D***a
发帖数: 516 | 33 以后就看不出来western blot造假了，全是电脑做出的条带。 |
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r******k
发帖数: 446 | 34 这两天在extract early endosome。 然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
里面的变化。 我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
。 然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。 但是最后一步
early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
PAGE for western blot analyses.
我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后 我的蛋白在哪里？ 而且难道抽提以后还需要
vaccum dryer把蛋白都弄成干粉 然后加loading buffer煮了以后再上样？ |
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c**y
发帖数: 127 | 35 因为所在实验室要购买western blot imaging系统
请教各位大虾对以下仪器有用户体验的，
评价下performance（主要是sensitivity）和用户体验
1. Amershan 600 RGB (GE)
2. Fluorchem M (protein simple)
3. Chemidoc MP (BioRad)
非常感谢。 |
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A*********0
发帖数: 144 | 36 请问版上有没有同胞们做过methyl cytosine dot blot,完全没有经验，做出来的是空
心圆，不是实心圆，不知道为什么。在做实验之前，nylon membrane 需要用相应的
buffer打湿吗，还是不要打湿。不知道哪个环节出现了问题。谢谢。 |
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发帖数: 1 | 37 想找公司做一个2D western blot,请问做过的朋友用过哪家靠谱的公司呢？谢谢！ |
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d*****r
发帖数: 39446 | 39 【此篇文章是由自动发信系统所张贴】
blot 申请加入本俱乐部的请求已经通过审批, 成为本俱乐部的正式成员, 特此通知. |
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b**t
发帖数: 150 | 40 1, 你的昵称、或者喜欢大家怎么称呼你？
blot或者认识以后叫我名字就行
2, 简要描述自己：
一般人
3, 兴趣爱好：
LD从不上bbs，但是爱运动，我，在家看娃有空儿上网，爱看别人运动，所以这个账户
双重人格
4, 目前住的城市:
McLean, VA 22102
5, 生日星座血型:
天秤，O型；LD，射手
6, 你的其它背景（选答，例如籍贯、待过的城市；工作领域、单位；毕业学校、教育
背景等）
在国内一直呆在北京，LD同
在美国前一直新英格兰地区，LD Boston
后一直在这里
LD金融，我目前家政
7, 你对DC俱乐部的期待
呼朋唤友
8, 我已阅读并愿意遵守俱乐部部规。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 41 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 42 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 43 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bulletin (bulletin), 信区: Biology
标 题: 穷人的劳斯莱斯——五年western经验谈（转）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 2 23:29:05 2012, 美东)
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10... 阅读全帖 |
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d*******s
发帖数: 61 | 44 看过该网站回复人的帖子后，发现原来造假问题是异常严重的：WB里面，GAPDH的一张
图片被反复用在多个图中；而且在他们后来发表的其它 8 篇论文中，还存在相同的问
题！这是很明显的蓄意作假了。这些论文在下面用黑体标明：
7 Responses:
Well that was easy….In the v282#17p12363 paper, look at the GAPDH bands in
Figure 3A. Now go back to Figure 2C and look at the GAPDH bands. Lanes 4-5-6
are the same. They duplicated the blot.In the v283#29p20045 paper, Fig 3A
right panel GAPDH blot contains the same 2 bands as Fig. 5D.So, the “
mistake” appears to involve using the same GAPDH blot for different
experiments. ... 阅读全帖 |
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f*******l
发帖数: 8811 | 45 【 以下文字转载自 USANews 讨论区 】
发信人: Jerry0803 (Jerry and Tom), 信区: USANews
标 题: 这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 24 16:56:08 2010, 美东)
这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
直到出现media上被洒酒精，并且接二连三的发生，终于正式... 阅读全帖 |
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s*****k
发帖数: 2297 | 46 Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
直到出现media上被洒酒精，并且接二连三的发生，终于正式由警方介入。女博士
被审问两次，测谎一次，才给实验室安装了两个摄像头，并且非常震惊（对于他们，对
于我肯定是理所当然）的发现实验室新来的，“和蔼可亲，友好，健谈”的印度博后
Vipul Bhrigu从冰柜中取出自己的样品，然后拿起擦桌子消毒用的酒精spray往里面一
阵乱喷。
庭审判了8.8K的罚款和6个月probation,40小时社区服务，给实验室设备、研究进
度、人员工资造成的损失要开听证会确定，初步数字72K。Vipul Bhrigu坦... 阅读全帖 |
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J*******3
发帖数: 1651 | 47 这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
这个印度博后实在无耻：暗中破坏组员的实验半年终于被捕
直到出现media上被洒酒精，并且接二连三的发生，终于正式由警方介入。女博士
被审问两次，测谎一次，才给实验室安装了两个摄像头，并且非常震惊（对于他们，对
于我肯定是理所当然）的发现实验室新来的，“和蔼可亲，友好，健谈”的印度博后
Vipul Bhrigu从冰柜中取出自己的样品，然后拿起擦桌子消毒用的酒精spray往里面一
阵乱喷。
庭审判了8.8K... 阅读全帖 |
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s****2
发帖数: 4569 | 48 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: crazyman (嘉天之锡), 信区: Chemistry
标 题: 印度博后暗中破坏组员的实验半年终于被捕(图)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 24 17:28:16 2010, 美东)
发信人: sandvik (注册商标), 信区: Military
标 题: 印度博后暗中破坏组员的实验半年终于被捕(图)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 24 17:14:44 2010, 美东)
Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
直到出现med... 阅读全帖 |
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Q*K
发帖数: 3464 | 49 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: sandvik (注册商标), 信区: Military
标 题: 印度博后暗中破坏组员的实验半年终于被捕(图)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 24 17:14:44 2010, 美东)
Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
直到出现media上被洒酒精，并且接二连三的发生，终于正式由警方介入。女博士
被审问两次，测谎一次，才给实验室安装了两个摄像头，并且非常震惊（对于他们，对
于我肯定是理所当然）的发现实验室新来的，“和蔼可亲，友好，健谈”的印度博后
Vip... 阅读全帖 |
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s*****k
发帖数: 2297 | 50 Vipul Bhrigu，Toledo大学的博士，到Univ of Michigan Comprehensive Cancer
Center做博后。从09年12月开始“细致而系统”的暗中破坏同组博士女生Heather Ames
的样品。
女博士渐渐发现了问题，开始还以为是自己犯了错误，采取了一些措施防止出错，
甚至拿到未婚夫的实验室去做，总是有各种各样的问题。怀疑有人破坏，说给朋友，导
师，学校相关部门听，都劝她是不是自己多虑了，甚至认为是她自己工作不顺利，试图
归结于其他原因。
直到出现media上被洒酒精，并且接二连三的发生，终于正式由警方介入。女博士
被审问两次，测谎一次，才给实验室安装了两个摄像头，并且非常震惊（对于他们，对
于我肯定是理所当然）的发现实验室新来的，“和蔼可亲，友好，健谈”的印度博后
Vipul Bhrigu从冰柜中取出自己的样品，然后拿起擦桌子消毒用的酒精spray往里面一
阵乱喷。
庭审判了8.8K的罚款和6个月probation,40小时社区服务，给实验室设备、研究进
度、人员工资造成的损失要开听证会确定，初步数字72K。Vipul Bhrigu坦... 阅读全帖 |
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