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f******k
发帖数: 856 | 2 哎，也得老板有钱啊
Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-
Blotting/WBlot-misc/Protein-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System.html
QS=c76003443ff9837de9425a17e8c124d655fc81dd7b5a4fe1&gclid=CImPrPeqxqACFQUM
DQodDTEvaA |
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a***e
发帖数: 1010 | 3 (1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
increase the sensitivity of your probe (~10x).
(2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
(3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
northern blot
(4) deep sequencing w/ or w/o cloning |
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C*****h
发帖数: 926 | 4 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
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p****c
发帖数: 233 | 5 各位牛人，想请教一个问题如下：
我make了几个mammalian expressing constructs containing FLAG tagged Glycine
domain （150 amino acids ）。The sequencing results are correct。They all
have
KOZAK and are inframe. 但是，当我overexpress them individually in HEKT cells
，
Western blotting can not detect FLAG。 但其他 constructs containing these
Glycine domain fused with another protein domain can be detected by Western
blotting （FLAG）。
我百思不得其解。不知是因为these Glycine domain （150 aa）太小，再HEKT cell
里不稳定
被降解了吗？奇怪的是大蛋白（含有相同的Glycine domain but fu |
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p****c
发帖数: 233 | 6 各位牛人，想请教一个问题如下：
我make了几个mammalian expressing constructs containing FLAG tagged Glycine
domain （150 amino acids ）。The sequencing results are correct。They all
have
KOZAK and are inframe. 但是，当我overexpress them individually in HEKT cells
，
Western blotting can not detect FLAG。 但其他 constructs containing these
Glycine domain fused with another protein domain can be detected by Western
blotting （FLAG）。
我百思不得其解。不知是因为these Glycine domain （150 aa）太小，再HEKT cell
里不稳定
被降解了吗？奇怪的是大蛋白（含有相同的Glycine domain but fu |
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c****y
发帖数: 14 | 7 请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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s******r
发帖数: 2876 | 8 也许你的CMV promoter被甲基化了，换个promoter试试。
请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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G******O
发帖数: 189 | 9 You are right.
We should judge such one of a few best immunologists in a more professional
way. But this is based on our intergrity that we should present real
experiments. It is not solely an actin blot. It is the faith that all of the
scientists rely on. Futhermore, besides this blot there are at least three
papers from his lab showing manipulated data as you can read in this BBS.
I agree with you that it is not easy for most of hot stars. But such a
successful star with so much money and reso... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 yes, in most case you can use it. I would suggest you to test it first.
In principle, the concentration used for Immunohistology need to be diluted
for 10~100x for WB application.
I suggest you to load good negative control and positive control lanes in
your test run to confirm this ab works for your application.
ELISA |
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W*********n
发帖数: 775 | 11 谢谢 艳阳天！ 以前经常得到您的指点！
还有两点不明白：
1）一个对于某个肽段的抗体做出来之后，为何有的可以用在点杂交，免疫组化或者
western上， 有的不写可以在某方面应用呢？ 我觉得抗体（多抗）都是一种方式产出
来的，为何用途会不同？
2）关于一个检测磷酸化蛋白的抗体，我想检测的蛋白（另一个物种的）和抗体制备所
用的蛋白（人的）肽段，在磷酸化位点左右各4个（一共9个氨基酸）完全相同，再往两
侧就有些区别了。请问这种情况下，以磷酸化位点为中心的13个氨基酸的肽段，和磷酸
化位点为中心的30个氨基酸的肽段产生的多抗，用起来效果一样么？我觉得产生出来的
抗体应该只纯化出磷酸化位点相应的抗体， 否则其它位点的抗体，应该也能够识别非
磷酸化蛋白，这是磷酸化蛋白抗体所不允许的。 请您指点迷津。
谢谢！
diluted |
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s******y
发帖数: 28562 | 12
这个解释起来比较麻烦。
简单的讲吧，因为抗体在体内产生的时候，是识别一个经过免疫细胞处理过的
变性后的短肽，这个短肽和实际上的蛋白可能会有差别。所以有的抗体能够
识别作为抗原的短肽但不一定能够识别真正的蛋白，特别是在做免疫荧光的时候，很多
时候蛋白被formaldehyde固定后构象更接近于native protein 而不是变性的
短肽。
另外，有些时候有些抗体不适用于某些场合可能是因为在那个场合该抗体的非特异背景
太强。
这个是不能保证的。虽然一般而言大部分抗体的识别序列小于10个氨基酸，但是也会有
可能有些抗体可能会需要更多的氨基酸才能识别。
另外，有些抗体的识别只需要很少的氨基酸就可以了。比方说，有些抗体甚至可以
识别一个被磷酸化的tyrosine.
所以说抗体这种东西，是要试一试才能知道怎么回事的。根据理论做出的推测只
能作为推测，不能作为结论。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 Northern blot, Northern blot. Sorry my mistake :)
The good thing of northern is that you can directly see the real size of the
mRNA, which is not very doable with PCR
southern |
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K*F
发帖数: 120 | 14 去年暑假8月份开始，带一个美国本科生小弟做实验。
目的：我有一个课题，技术已经纯熟，需要一个人帮助，迅速出data。
实验流程：做点突变，表达蛋白，化学修饰，SDS-PAGE，western blot，做一个突变的
全流程需要6
天时间。
效果：过了近半年了，小弟学得很慢，至今尚且没有做完一个全流程，只能做中间的某
一个步骤，比
如，提质粒，化学修饰，或者表达蛋白。western blot技巧性太强，他尚且没学。
小弟的目的：拿到co-authorship，以及我老板的推荐信，申请medical school。
前几天过新年，我发邮件给他，希望他刻苦点，希望他成为一个优秀的undergraduate
researcher，我们并且要求他一个星期工作20小时。
今天，小弟揭竿了，他说20小时太多了。。。经过bargain，他说10小时还行。
那么就是说，他每个实验需要我给他准备好sample，他不能够独立完成实验，小弟只想
做个打杂的
hourly worker，而且最后我还要给他第二作者。我今天跟我老板摊牌了，我老板说让
我自己决断，
可以让小弟滚蛋，或者留着打杂，但是没有co-aut... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 15 与人方便，与己方便，
打个杂，给个authorship对你有什么损失吗？
去年暑假8月份开始，带一个美国本科生小弟做实验。
目的：我有一个课题，技术已经纯熟，需要一个人帮助，迅速出data。
实验流程：做点突变，表达蛋白，化学修饰，SDS-PAGE，western blot，做一个突变的
全流程需要6
天时间。
效果：过了近半年了，小弟学得很慢，至今尚且没有做完一个全流程，只能做中间的某
一个步骤，比
如，提质粒，化学修饰，或者表达蛋白。western blot技巧性太强，他尚且没学。
小弟的目的：拿到co-authorship，以及我老板的推荐信，申请medical school。
前几天过新年，我发邮件给他，希望他刻苦点，希望他成为一个优秀的undergraduate
researcher，我们并且要求他一个星期工作20小时。
今天，小弟揭竿了，他说20小时太多了。。。经过bargain，他说10小时还行。
那么就是说，他每个实验需要我给他准备好sample，他不能够独立完成实验，小弟只想
做个打杂的
hourly worker，而且最后我还要给他第二作者。我今天跟我老板摊牌了，... 阅读全帖 |
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a*********7
发帖数: 342 | 16 谢谢大家的帮助，我还有一些信息：
大概就大１，２个KD, 从western blot 上看. 我觉的不可能是stop codon 的问题，因
为我已经试过不同的载体了，每个载体都出现一样的结果. 而且我 试过只delete最末
端２个aa, 结果在western blot 上看和野生型没区别。为什么多delete 3个就大了呢
，我个人觉的可能是deletion 导致结构变化，然后出现了不同的posttranslational
modification. 大家觉的有没有道理？ |
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c*2
发帖数: 24 | 17 Just a follow-up on this. In case some of you are interested. I emailed the
author and here is his response.
==
Thanks for your interest and your question. We made the same observation as
you did. Trp53 is represented by multiple probe sets (1438808_at, 1438542_at
, 1459780_at, 1457623_x_at, 1427739_a_at, 1426538_a_at) and only one of them
shows indeed upregulation in Imatinib-treated BCL6-/- leukemia cells (i.e.
the one you can see in Figure S6). Figure S6 shows examples of microarray
probe set... 阅读全帖 |
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v***a
发帖数: 1242 | 18 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！ |
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g******u
发帖数: 66 | 19 最近被一个问题困扰着:
用某种通道蛋白的抗体(通过Western blot和immunohistochemistry) 来研究此蛋白在
一个组织中的表达情况.在大批量的实验前,先做了个预实验测试了下此抗体的特异性.
很奇怪的是,Western blot和immunohistochemistry 都显示在此蛋白完全敲除的动物组
织中还是有弱的阳性表达(和wild-type相比是很弱,但还是能看到非常弱的条带或者染
色).
难道是一抗或者二抗的浓度过大?还是封闭的不够?
注: 1. 此抗体已经有几篇发表的文章显示是特异性的
2. 基因敲除的动物应该没有问题
3. 弱的阳性表达应该不是来自自发荧光或者artifact
非常感谢您的建议和分析!!! |
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d****7
发帖数: 109 | 20 Before lib prep., to increase confidence，run 10% elutes on western blot to
check whether the protein is successfully pulled down. However, western blot
cannot guarantee the work of ChIP. |
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i*****g
发帖数: 11893 | 21 option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
hopefully protein would not renature after blot transfer
option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
handle tiny amount of proteins for mass spec)
alkylating agent, iodoacetamide.
option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
transfer
option1-----4 easiness ... 阅读全帖 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 22 option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
hopefully protein would not renature after blot transfer
option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
handle tiny amount of proteins for mass spec)
alkylating agent, iodoacetamide.
option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
transfer
option1-----4 easiness ... 阅读全帖 |
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q********0
发帖数: 92 | 23 恩 是有点儿懒 我是觉得我老板写作方式很奇怪。。。和别人的貌似不大一样
比如这句话
Western blot results showed that xxx vs PBS treatment also increased xxx
protein expression (Fig. 3D and E) significantly at 1 day p.i. (p=0.01) with
no difference between the two groups at 5 days after infection.
我可能就写：
Western blot results showed that when compare with PBS treatment, xxx also
increased xxx expression at the protein levels (Fig. 3D and E) significantly
at 1 day p.i. (p=0.01). However, there is no difference between the two
groups at 5 d... 阅读全帖 |
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D*******8
发帖数: 4 | 24 Please don’t dig me out. I am writing this out of my conscience as a
scientist. We are using, largely, the tax payers’ money to explore
mechanisms underlying diseases that we don’t have a cure, yet. We are doing
this in the hope that little bit knowledge can accumulate till one day we
can find that magic bullet. However, there are people out there, their
purpose is to use these money to achieve their personal fames, sometimes
international ones, totally disregarding our original noble cause. I... 阅读全帖 |
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m**********3
发帖数: 706 | 25 大部分杂志都不建议调。如果实在要调，必须要对整个BLOT调而不是单独调一个带。同
时反对过度PS。像NCB这样的杂志最后要把原始BLOT放在SUPPLEMENTARY 里面，我觉得
这是个很好的开始。 |
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n****e
发帖数: 327 | 26 This is outrageous!
On the original scan, from left to right, Lanes 7 and 9 were overloaded,
resulting in higher level signals for all three proteins. The Vinculin
signal was very strong and reached saturation, so that the difference in
loading wasn’t obvious. Yet, lanes 7 and 9 were overloaded as indicated by
the non-specific bands between 76kDa and 120 kDa.
However, in the published figure, the P-p53 and p21 blots were flipped
horizontally, but the Vinculin blot wasn’t flipped. In this way the... 阅读全帖 |
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m*********e
发帖数: 378 | 27 我在人家那里贴的快要歪楼了，还是在这里自己开个贴吧
今年夏天毕业，刚从thesis里面抽出点身来找工作，想作technician 或者specialist
的工作
本着实事求是的态度在这里老老实实的写写自己会的技术
现在经常做的有 western, GFP-fusion protein expression in mammalian cells,
flow cytometry of TUNEL assay, enzyme assay （proteasom, HDAC，cell
proliferation), cell and small animal handling
近年用到但不是很经常做的有 realtime, PCR array, IFHC, ELISA, coomassie blue
staining, genotyping
曾经完全掌握一天之内捡起来的有 plasmid construction, IP
曾经做过需要点时间上手的有 map-based cloning, expression of recombinant
protein (miRNA) in plants, a... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 28 按巴黎统筹规定
禁止出口后清的吧
全自动的western blot machine Made in Germany/France/USA
//www.referenceforbusiness.com/encyclopedia/Con-Cos/Coordinating-Committee-for-Multilateral-
Export-Controls-and-the-Wassenaar-Arrangement.html#b
証明和军用单位完全无关以前 比如美国总领事馆以内用的除外
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31590799.html
同主题阅读：有人用过或者知道自动的western blot machine 么？
[版面:生物学][首篇作者：sunnyday] , 2011年10月24日 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 我在研究生院的时候从来没有做过western blot...
细胞组化倒是常作，但是azide 并不影响抗体结合，所以immunochemistry 里面
常常用它的，所以我当时就把这个习惯带到western blot 里去了。
另外，二抗并不是越用越干净吧，我猜其实是越用越弱了，然后弱的信号看起来都
会干净一些吧？ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 30 果然
大快人心！
RETRACTED: Enhanced Polyubiquitination of Shank3 and NMDA Receptor in a
Mouse Model of Autism
M Ali Bangash1, Joo Min Park1, 6, Tatiana Melnikova2, 6, Dehua Wang4, 6, Soo
Kyeong Jeon1, Deidre Lee2, Sbaa Syeda2, Juno Kim1, Mehreen Kouser3, Joshua
Schwartz1, Yiyuan Cui4, Xia Zhao4, Haley E. Speed3, Sara E. Kee3, Jian Cheng
Tu1, Jia-Hua Hu1, Ronald S. Petralia5, David J. Linden1, Craig M. Powell3,
Alena Savonenko2, Bo Xiao1, 4 and Paul F. Worley1, ,
1 Department of Neuroscience, Johns Hop... 阅读全帖 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 31 很久没有用了，GST Ab 很好做的
V5 以前用的invitrogen，确实好用
还有，用抗体，可以用BSA-TBS 溶液 配，用non fat milk特别容易坏
后来为了省抗体，还用过一招
桌面上，saran wrap 上面，放blot，然后用最低量滴上blot，能看见液面鼓起来就可
以了，然后用盖子盖上，2小时后，做下一步，挺好用的
如果抗体specific很好，可以用TBS-BSA solution，加一点点Ab，就可以了，
可以省不少Ab |
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g*******f
发帖数: 427 | 32 请求推荐好用又便宜的 SMART NCoR western blot 或 ChIP 抗体。 Abcam 的一个抗
体要365 刀，简直是喝人的血啊。我估摸着做ChIP 还是得用Abcam的， western blot
不知道有没有同志推荐的，我用过 Sant Cruz的没做出来。
多谢了 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 sure
2000-2009 nine years no advance within Retraction Cell papers.
Retraction of 'DNA-PKcs is required for activation of innate immunity by
immunostimulatory DNA’
In a recent issue of Cell, the above paper was retracted. The authors stated
that during figure preparation, several loading controls were
inappropriately manipulated. These artificial changes may affected the
credibility and interpretability of the paper. However, the conclusion of
the retracted paper holds true. The authors include... 阅读全帖 |
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a****k
发帖数: 1130 | 34 如果按照你说的，那个人中间拿放两次，很有可能是在做pre-hyb或者已经开始wash了
，hyb的过程中是不用拿出来的。如果是我说的那两个过程，pre-hyb还没加同位素，
wash的话管子本身基本都可以挡住了。正规的oven是能够挡的，你要还是不放心，下回
别人做的时候你让那人拿geiger counter在你站的位子测一测呗。不过已经都这样了，
还是放宽心 |
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n********k
发帖数: 2818 | 35 google 呀，我不负责任的说哈，她这样担心造成的影响可能比下午的影响大多了。那
点同位素的强度到胎盘估计已经是零了。都不知道有多少人问这种问题了，就不能有这
时间上网学习以下么，如果真担心而且本着对孩子负责的话。
其实实验室比同位素毒的东西不要太多呀，偏偏人人谈同位素色变，但是在其他化学
试剂上却又不够小心。我曾经计算过买1微居的量，完全打开，不加任何防护，要照好
几个小时好像还到不了年度限量。 |
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a****k
发帖数: 1130 | 36 年限度量好像是遥不可及的。。天天p32的，戴的戒指也从来没到过
准妈妈都担心很多的，这个我开始理解了。。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 37 wow, that sounds like a big news:))) |
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b********a
发帖数: 79 | 38 谢谢大家的信息!我试图google过，但goo不出来什么东西，可能key word用的不好。还
是论坛强大呀，呵呵。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 don't worry about it, and your tummy could block the 32p.
it is not so horrible. |
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I***a
发帖数: 13467 | 41 今天翻出n多带标记的二抗，做western blot的，HRP标记的
还有FITC标记的，
估计10年都用不完，有些放在4度，好几年，有的在－20度，
一抗也不少
不知道还用么？
有用的话，怎么长期保存，
吐槽一下，真他妈的汗，多少年没人做western blot，试剂一大堆。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 42 一般加成50%甘油，-20C可以放个3-5年
今天翻出n多带标记的二抗，做western blot的，HRP标记的
还有FITC标记的，
估计10年都用不完，有些放在4度，好几年，有的在－20度，
一抗也不少
不知道还用么？
有用的话，怎么长期保存，
吐槽一下，真他妈的汗，多少年没人做western blot，试剂一大堆。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 43 目前正在做一个蛋白H。见附件GFP-H在293中表达：blot anti-GFP，H理论大小130kd，
GFP-H 150kd上面总有很深的背景。flag-H blot flag也类似：在130kd上有类似很深条
带。
蛋白可能有修饰么？泛素化？但好像一般泛素化检测需要转染Ub后才比较明显（不太清
楚），有类似例子么。
或是293 over-expression 有时会出现这种情况。
重复过多次不同的cell lysates，所以上面的背景应该不是实验操作原因。
谢谢 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 44 的确,48小时没有明显的细胞凋亡.要到72小时才有.但对照组没有p-AKT啊!
而且Western Blot收集死和活(both)的细胞啊.(对了,我的细胞是悬浮培养的不是贴壁
的,如果是贴壁,到是可能取的都是活细胞做Western Blot) |
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d*****s
发帖数: 647 | 45 我们以前做过eNOS的dimer和monomer，程序如下：
正常提取蛋白，按照常规Western Blot准备标本
将标本分为2份：一份boiled，一份unboiled
在4度下跑SDS-PAGE胶
然后Western blot程序
最好在胶片上判断：Boiled的标本只有1条monomer带，unboiled的标本在2倍monomer分
子量位
置有条带表示是dimer |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 Sounds reasonable.
But key point is 让人怀疑作者检测到的human HBV infected cccDNA是否是真的
human HBV infected cccDNA?
details please refer
. 文章中用Southern blotting检测到了cccDNA的形成。cccDNA是HBV转录的膜板，被认
为是HBV持续感染的关键因素。从结果来看cccDNA的形成时间与HBV蛋白、RNA和DNA相比
比较早，尤其量很高。其实对于HBV来说哪怕是CMV启动的HBV（比如pCMV-HBV）cccDNA
的量都是很低的，更不要说是自身启动子启动的了。在NTCP介导的HBV复制水平整体很
低的情况下，具有高水平的cccDNA形成，让人怀疑作者检测到的cccDNA是否是真的
cccDNA，所以作者必须证明他们所指示的条带是真的是cccDNA，必须用EcoRI酶切（
cccDNA能被EcoRI线性化）和加热煮沸cccDNA（沸腾后不会被解成单链）来确证，同时
必须要有阳性对照。当然对于鸭乙肝病毒（DHBV）
http://blog.scien... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 47 Sounds reasonable.
But key point is 让人怀疑作者检测到的human HBV infected cccDNA是否是真的
human HBV infected cccDNA?
details please refer
. 文章中用Southern blotting检测到了cccDNA的形成。cccDNA是HBV转录的膜板，被认
为是HBV持续感染的关键因素。从结果来看cccDNA的形成时间与HBV蛋白、RNA和DNA相比
比较早，尤其量很高。其实对于HBV来说哪怕是CMV启动的HBV（比如pCMV-HBV）cccDNA
的量都是很低的，更不要说是自身启动子启动的了。在NTCP介导的HBV复制水平整体很
低的情况下，具有高水平的cccDNA形成，让人怀疑作者检测到的cccDNA是否是真的
cccDNA，所以作者必须证明他们所指示的条带是真的是cccDNA，必须用EcoRI酶切（
cccDNA能被EcoRI线性化）和加热煮沸cccDNA（沸腾后不会被解成单链）来确证，同时
必须要有阳性对照。当然对于鸭乙肝病毒（DHBV）
http://blog.scien... 阅读全帖 |
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P*******1
发帖数: 169 | 48 打中文实在慢， 以下用英文.
Below is a fiction based on a true story I heard. "I" represents the person
who told me the story. Details are modified for confidentiality, but the
essence remains.
.................................
He published 2 small SCI papers back in his home country (like impact factor
2ish. Not bad considering where he was coming from. To protect his identity,
I will not reveal where he came from. I did have post-docs from multiple
different countries.). I phone interviewed him, and he kne... 阅读全帖 |
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s*****r
发帖数: 7 | 50 首先，你的蛋白是多位点磷酸化的,先用anti-Pser做IP,不管wild type和mutant可能都
会抓下来,后面的blot还是没区别.
建议：
1 现在有个叫phostag的试剂，可以通过SDS-PAGE条带区别出不同磷酸化状态，在配胶
的时候加入，run gel后用你蛋白的抗体blot，用这个可以粗略分析。
2 如果想知道突变影响的具体磷酸化位点，那可以就把两个蛋白表达纯化出来，typsin
酶解后找个kit（GL sciences，Sigma，Promega等）提取磷酸肽，然后上质谱鉴定各自
的磷酸化位点吧。
IP |
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