l****n
发帖数: 3 | 1 But I selected both the stable clone and stable pool with antibiotics.So
every cell in the stable pool should more or less stably express this
protein. |
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h*y
发帖数: 208 | 2 我们做小鼠，想看看酵母中的GCN5在小鼠中是否起作用。大家知道在哪里可以买到酵母
GCN5的clone. |
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W*****o
发帖数: 1780 | 3 pFU HF PCR product is blunt-end. What should I do for a TA cloning? Thanks. |
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s*******n
发帖数: 37 | 4 最近做了一个small rna library(~40-60 bp)，adaptor ligation, cDNA ，ＰＣＲ，
gel purification 做的都没问题，在送去大规模测序前想做个Topo-TA cloning, 先挑
几个克隆测测，做了两次都没什么真的克隆，也就十几个，不知道板上有没有人有这方
面的经验。谢谢。 |
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s*******n
发帖数: 37 | 5 除了Topo-TA cloning 还有什么好的系统？ |
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B******o
发帖数: 496 | 6 可以用 TOPO blunt end cloning先做了再转嘛
按照phusion的说明书，你得纯化。至于加A overhang的效率咋样，俺就不清楚了 |
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s********n
发帖数: 2939 | 7 Statagene好像有一个Pfu是高保真但同时能加A的；Lucigen有GC cloning vector，据
说效率比TA要高不少。 |
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X******n
发帖数: 914 | 9 比如做100个4000bp左右的基因，放到pDONR223里面大概要多少钱？
如果直接买entry clone，那些公司比较便宜呢？ |
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k**o
发帖数: 15334 | 10 目前科技水平，能clone一批翼龙，然后将其训练到可以载人飞行不？
我觉得阿凡达里面那群小蓝人骑大鸟飞行，太爽了。 |
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m*****y
发帖数: 857 | 12 我自己提供载体，要求把载体里的GFP去掉，换成我提供的蛋白基因，然后包装成
LENTIVIRUS， TITER最好高一点，不过TITER不太重要，可以只做CLONING，然后提供
一点LENTIVIRUS我来检验蛋白表达和活性，然后我去找其他公司去做高产量的
LENTIVIRUS也行。
求推荐！！！//BOW |
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x********u
发帖数: 430 | 13 Is it possible that I insert a 6Kb fragment into a 8Kb vector? I have
repeated three times and have no luck geting any colonies. For construct
below 10Kb, I am very confident (>80%) and I can always get the right
transformants after screening. Is there any tricks for this big fragment
cloning? I know all my gene can be functionally expressed in E coli, so
there is no protein toxicity issue. |
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B*********r
发帖数: 19 | 14 TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
接？
用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。 |
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B*********r
发帖数: 19 | 15 感谢诸位的意见！
本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
是case by case了吧。
PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢
唉，看来还是干实验比较轻松愉快，湿实验太揪心了。。。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 16 从cDNA中clone一个6k的gene
Phusion号称可以，但效率仍然很低。
分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site. |
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r******y
发帖数: 21907 | 17 我用的是NEB Phusion HF MM做的PCR 然后直接用去TA cloning了 后来一看这种应该是
blunt end 可是我竟然得到很多克隆 提了质粒送去测序也正确 可是理论上应该连接不
上才对啊 因为没有那个A 谁能解释一下这是咋回事儿？难道是因为我的gene最后一个
是A？@@ |
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b******r
发帖数: 111 | 18 Hi,everyone,
I have to use single restriction sites for insertion of multiple fragments
. When using KpnI site, just get one successful insertion from 70 clones.
For NotI, it is 1 from 4,BamHI is 1 from 2. My question is why the ligation
is so bad at KpnI site? Or other reasons? Thanks |
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l******o
发帖数: 103 | 19 四年的phd，今天数数做了近70个clones了，mutate来mutate去。
最近遇到一巨大plasmid，要在一点引入突变，
要想得到正确的质粒，得弄3个intermediate plasmids，
今天回来的测序结果还不对，还得返工。
so frustrated！
project每前进一步就得准备这种，
这种project真揪心啊！ |
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l******o
发帖数: 103 | 20 I have the following problem. I want to introduce a point mutation to my
plasmid. The plasmid is super big. So I first cut out a fragment(~4kb) with
XbaI and then ligate it to another vector. After introducing mutation with
mutagenesis kit, the sequencing result is as expected.
Next step is to put the XbaI-XbaI fragment containing the mutation back
into the original clone. After ligation and transformation with DH5alpha I
get a number of colonies (~20) but no colonies in the negative control. B... 阅读全帖 |
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r****r
发帖数: 36 | 21 Indeed, it's more difficult to manipulate big constructs than small
constructs with ligation method. So sometimes I used yeast recombination to
handle big constructs. The drawback of using yeast is the high mutation rate
. I always have to use several independent clones to confirm my observation
was really due to my mutations instead of random mutations caused by yeast. |
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w******d
发帖数: 46 | 22 Anybody used this cloning kit from Invitrogen? I am trying to persuade my
boss to get the 3-fragment one, but it's not cheap (>$2000) and my boss is a
cheap one.
If you used it, what you like it? Doesn it worth the money?
Thanks! |
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H*****e
发帖数: 120 | 23 I believe that they cloned by RT-PCR. I had ordered some. Some work and
some does not. After sequencing, I saw many mutations. In terms of price
and effort to sort them out, I synthesis them. |
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l******g
发帖数: 1623 | 24 不想做广告，你随便用你origene里的RefSeq ID 加上 “cDNA clone“或者类似字样，
google一下，会有很多公司在卖 |
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X***n
发帖数: 366 | 25 楼上正解，google:
OE-PCR
CPEC cloning |
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j****n
发帖数: 3370 | 26 可以用Gibson assembly
或者homologous recombination based cloning
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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z*h
发帖数: 773 | 27 Simple Cloning: direct transformation of PCR product (DNA multimer) to
Escherichia coli and Bacillus subtilis
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in Escherichia coli [e.g., TOP10, DH5α, JM109, BL21(DE3)] and
Bacillus subtilis for obtaining chimeric plasmids.
http://aem.asm.org/content/early/2011/12/16/AEM... 阅读全帖 |
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d**p
发帖数: 149 | 28 Why do not modify your current plasmid? I did a lot modification by myself
to meet the clone requirement. There is no perfect plasmid for every purpose.
有 |
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H*******i
发帖数: 196 | 29 Clone 一个pmb1（PUC）的origin+一个kan/clora的抗性，酶切位点选KpnI/XhoI
把基因插进去好了。。
一共两个/三个片段，太简单了。 |
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c*******7
发帖数: 314 | 30 tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问 |
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m*******3
发帖数: 25 | 31 I want to clone some genes into the pET30a vector and the p
GBKT7 vector which both contain an N-terminus tag,do I have to exclude the
ATG in my own gene? |
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B******o
发帖数: 496 | 32 不好意思，白天太忙没上买买提。 我们已经筛好的细胞都是699.
如果需要customerized的话，一般而言我们从筛选开始2-3周deliver cell mixture，
一个月内做好单克隆。Inducible系统我们能拿到比较高的阳性克隆，一般筛12个，然
后挑最好的给你。你需要提供想要转入的基因，我们clone进inducible系统，基因太大
的可能会有时间上的延后。总体时间1个半月可能是比较保险的。
细胞系，如果我们inhouse已经有的，做完的价格大概在1500左右，只要mixture大概
1000-1200。
如果你的细胞比较特别，比如胚胎干细胞，价格会有不同。因为本来培养这类细胞的试
剂就比较贵，相信你也能理解吧:) |
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m******t
发帖数: 109 | 33 在做cloning，用BGL１和BspE1切，切出来的BANDS不对。应该只有２条BANDS，因为
PLASMID只有一个BGL１和一个BSPE１切点。 但切出５，６条，而且目标大小的BAND还
没有。 请各位指教 |
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j******i
发帖数: 939 | 34 你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。 |
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x******o
发帖数: 76 | 35 试过DH5a也做不出来，而且DH5a难道不是不适合做unstable clone吗？
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？ |
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M******g
发帖数: 152 | 36 sequencing is so cheap and easy nowadays.
I have cloned a 6.3 kb gene using Q5 pcr and seen no mutations. I love Q5
and gibson assembly. highly recommend them to you. |
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x********e
发帖数: 35261 | 37 你可以去网上搜Gibson cloning的原始paper, mix的主要成分就是T5和Phusion. NEB就
是改进了下比例。有人直接用那篇paper上给的recipe配,也能做 |
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m******t
发帖数: 109 | 38 在做个MUTATION PLASMID。 在T－VEC里有这个MUTATION，可是转到我要的VECTOR里就
变成WT。 高手解释下。 多谢拉 我当然会继续挑索要的CLONE |
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l*******r
发帖数: 63 | 39 各位大佬： 现在有好多家的crispr/cas cloning kit, 不知道哪家的好用？我想做一
个sufrace protein的deletion.
多谢！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 40 This is transformation not cloning.
Looks about right. Just think 200 ng is too much. 20-50 ng is enough.
put
the |
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H****s
发帖数: 301 | 41 就是PCR产物和载体共转化，不需要连接反应的那种。Invitrogen的TOPO cloning试剂
盒太贵了。 |
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T****i
发帖数: 15191 | 42 TOPO cloning 很差，也很过时了。
推荐 Cold Fusion。我曾经一次性克隆拼接3个PCR片段，竟然也得到了几个克隆。
Clontech 的Infusion 也是一样原理，不过没用过。Gibson Assembly我试过，不行，
也许是个例。 |
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M******g
发帖数: 152 | 43 you can try NEB PCR cloning kit. It is very good and efficient. |
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k******a
发帖数: 23 | 44 可以试试genscript的clone ez 挺便宜，效果也不错 |
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w**********k
发帖数: 386 | 45 你不是在公司工作吗？ topo cloning 这点钱是毛毛雨啊。
要不老纳给你推荐 isothermal ligation, 用了多说好。 算+能量吧 |
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H*******i
发帖数: 196 | 46 Linear DNA 转化？ 那必须是电转吧？
而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊 |
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n*******d
发帖数: 41 | 47 不是电转，用的trans5a,确实不是每个公司的dh5a都能出
欢迎尝试大肠菌神教克隆大法，
克隆大法好！
：Linear DNA 转化？ 那必须是电转吧？
：而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊 |
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发帖数: 1 | 48 请问各位有没有好的cDNA clone公司推荐。
现在想克隆一条lncRNA 求哪里比较有完全的full length的DNA库？
谢谢大家！ |
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s******y
发帖数: 17729 | 49 哪的看开多少钱了，cloning做的好的锁男大把大把的。弯曲你要开不到十万，鬼才去 |
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W****g
发帖数: 690 | 50 去贫困线是30万的湾区做生物？除非家里有个做IT的。
: 哪的看开多少钱了，cloning做的好的锁男大把大把的。弯曲你要开不到十万，
鬼才去
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