l**********1
发帖数: 5204 | 1 //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15903968
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19222862
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20725638
Ps: if you are satisfied with above links.
BAOZI 2 please transfer to my MITBBS account here. |
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l**********t
发帖数: 138 | 4 sigma有DMSO solution卖，4度保存，非常非常的好使！ |
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r*******y
发帖数: 48 | 5 use DMSO, store at -20, at least stable for two weeks. |
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C******d
发帖数: 362 | 6 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
PCR 反应溶液组分：
DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
taqman probe: 2 pmol
primers: 4 pmol
master mix: 10 ul
总共： 20 uL
real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
曲线？
primer和probe，都是按文献设计做的。莫非是仪器设置的问题？还是其他莫名原因？
跪谢！！！！ |
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N2
发帖数: 81 | 7 primers:
Forward primer: the matched part should be 30-35mer, tm~65C,
Reverse primer: should be >30-35er, could be 40-55mer if you don't have a
tail, the long the better, matched base pairs have tm around 65.
cycles:
using phusion polymerase, add 5% DMSO(2.5ul/50ul), annealing temperature>=
68C.
For the long primer pcr, the main problem is the primer dimer and the second
structure of the primer. So you need a long matched length to give space to
increase the annealing temperature and break any p... 阅读全帖 |
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L*****t
发帖数: 56 | 8 以前做PCR扩不出来就往里面加DMSO，从3%开始往上加到10%一般都能做出来，比退火温度梯度什么的有效多了。文献里说加甜菜碱也可以不过没用过。 |
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a*****v
发帖数: 128 | 9 如题
蛋白质溶于水溶液，但是药物只溶于Ethanol和DMSO， ACN。
然后我最低可以用50%ACN溶解该药物，
但是滴定到蛋白质溶液中立刻就沉淀了。
最终是要作蛋白质NMR，不能用有机溶剂让蛋白质变性阿。
而且该药物还是用于口服的药物，这是怎么起作用的呢？
碰到这种情况，大家怎么办呢？ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 11 口服药是要加辅助剂的.否则那么多中间药厂就要黄了.辅助剂可以是醇类,可以是...
去制剂版问问吧.
至于你的实验.可以采取楼上大侠的建议.
也用DMSO制备高浓度储备液,再用PBS或MEDIUM(处理细胞的培养液)制备第二储备液,把第二储备液放进MEDIUM步或水里达到你的最终浓度.(本人是这么做的) |
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a*****v
发帖数: 128 | 12 事实上蛋白质溶液中是有detergent的，DPC，但是还是不溶解啊
还有，我不是做细胞实验的，细胞实验中的确是用DMSO做的，这个基本已经是通用方法
了，但是做结构的还没见有人加有机溶剂的...
纯化这个膜蛋白头大啊，一个月才纯化那么一点... |
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a*****v
发帖数: 128 | 13 我不是做细胞实验的啊...
细胞实验DMSO是常用方法...
把第二储备液放进MEDIUM步或水里达到你的最终浓度.(本人是这么做的) |
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q*******8
发帖数: 768 | 14 不能这么说，不同实验室做出来不同结果是很正常的，也是可以解释的，比如之前某人
做的时候用了一种要抑制剂以为是特定的，后来发现抑制剂有别的功能；有的人药品用
酒精溶，有的人用DMSO溶，有时候会有截然不同的结果。。。这是科研向前走的必由之
路呀~ |
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a*****2
发帖数: 175 | 15 还有请问有人把U0126用到动物上过么,比如果蝇or老鼠? |
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x*****4
发帖数: 27 | 16 我也是这样想。其实真的，最好是博士都不做实验，所有的实验都外包。这样反而有好
处，一个是质量容易控制，减少人为因素。一个是利于双盲检测，减少主管误差。另外
抱怨生物需要掌握更多知识的人也有时间去真正读点教科书和文献了。
凡是说某某有一双灵巧的手，别人做不出的实验他能做出来的，要不就是他把他灵巧的
手的那个TRICK告诉大家，要不他做出来的结果不可信---因为不是standard 情况下做
出来的，你不知道里面发生了什么。
DMSO |
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y****y
发帖数: 123 | 18 DMSO是打开template用的
据说AT没有GC效果那么好但是也可以用
我也只是听说没实际用过 |
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b******i
发帖数: 287 | 19 好的！谢谢！那我先试试DMSO，不行的话就买上面提到的试剂。 |
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C********4
发帖数: 308 | 20 能不能加上DMSO和血清泡上，放冻存盒里，慢慢降温到-80、液氮，再快速升温到37？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 细胞冻了是可以样，因为死个20%也没关系。你老鼠不说
升降温dmso渗透不均匀，你说突然死个20%细胞还能活么？
至于后果，反正如果被发现，实验室肯定完蛋，至少关门
1年写检查。学校如果报告，就要受处罚。如果学校偷偷cover
up, 如果被查出来，整个学校的nih funding全部冻结 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 22 不行。别说整只动物，就是大坨组织，这种冻法也不行。因为血清DMSO不能均匀渗透到
组织中，复苏以后细胞活率很低的 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 23 dmso 缓慢冷冻到液氮温度 300Y later 快速解冻后 用那会的大脑matrix transfer
technology 10 min 搞定 cs or bioinformatics PhD memory and neuron actions
materials plus N GB memory transfer to your brain (high possibility) |
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n***w
发帖数: 2405 | 24 唉给小小鼠ip。。。
当时看了paper说inject brdu (dissolved in dmso)是ip的，我就试了一下，结果刷刷
的，小小鼠就给挤出来，最后还是sc好使。。。不过我只要等一两个小时，sc不适用于
tamoxifen吧。。。
有些东西，就是得learn in a hard way... |
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G********e
发帖数: 528 | 25 核酸是水溶性的，为什么要加有毒的DMSO?
你找错文献了 |
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n***w
发帖数: 2405 | 26 BrdU在水里最多是10mg/ml...然后我用的剂量是100ug/g body weight....
所以得配高浓度的BrdU... 所以就需要用DMSO... |
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O*********e
发帖数: 79 | 27 Mammalian cell culture, 要把细胞冻起来，当时有点事，就把加了DMSO的细胞放在－
２０度冰箱里，准备一会儿忙完了就转到－８０，哪知道忙着忙着就忘记了，等想起来
就是两天以后了。请问，这个细胞还能要吗？谢谢！ |
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K**R
发帖数: 193 | 28 求助各位大侠两个问题，很着急，谢谢了！
1 我提取原代细胞后 加入5% DMSO 和medium 放入-80 冰箱过夜，在放入液氮，这样方
法对吗？应为样品及其宝贵
2 第二部有个逆转录载体质粒，我不想包装了，可以用普通lipofectamiane2000 等试
剂来转染吗？
效率一般是多少，
多谢大家了！ |
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C********4
发帖数: 308 | 29 怎么那么多实验室都没有细胞冻纯盒啊？很便宜的，一个几十美元，里面灌满异丙醇。
自制的不知道好用不。找个塑料盒子，里面内衬一层海绵，装满异丙醇，把冻存管放EP
试管架里，使试管架下部浸入异丙醇里，
那么珍贵的样品，不如买一个或者借一个冻存盒咯。细胞在冻存盒里面在－80度大于4
个小时，就可以转入液氮了。
最好用90%的血清＋10%的DMSO冻细胞，这样对细胞的保护作用最好，复苏后几乎没有死
细胞。 |
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C********4
发帖数: 308 | 30 我喜欢用90%纯血清+10%DMSO
这样比掺杂了DMEM的对细胞的保护更好 |
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a******7
发帖数: 7936 | 31 没有冻存盒可以试试：
4度20分钟
-20度30分钟
-80度过夜
第二天放到液氮里
90-95%FBS+10-5%DMSO |
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j****x
发帖数: 1704 | 32 低吗？我怎么真心觉得不低了啊，你得横向比，已经达到甚至超过了HepaRG的水平（当
然也有可能是他们养的不好），低于PHH（这个就太正常咯）。能有10%的细胞被感染，
能正常形成cccDNA，能包装并释放病毒，这些data就足够了。
还是那句话，从viral entry之后还有很多步，每一步都可能决定着productive
infection的效率，不能都算到receptor的头上来。
我同意很可能是receptor components的其中一员，其他的成员没准还包括LDLR在内。
我想文章的作者也没有否认这种可能性的存在吧。至于说起IL6这个例子就有点搞笑了
，分泌蛋白作为受体那真的是要毁我三观啦。如果把任何可能促进entry的分子都叫做
受体，那么首先要提名的，必然是DMSO了，呵呵 |
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j****x
发帖数: 1704 | 33 低吗？我怎么真心觉得不低了啊，你得横向比，已经达到甚至超过了HepaRG的水平（当
然也有可能是他们养的不好），低于PHH（这个就太正常咯）。能有10%的细胞被感染，
能正常形成cccDNA，能包装并释放病毒，这些data就足够了。
还是那句话，从viral entry之后还有很多步，每一步都可能决定着productive
infection的效率，不能都算到receptor的头上来。
我同意很可能是receptor components的其中一员，其他的成员没准还包括LDLR在内。
我想文章的作者也没有否认这种可能性的存在吧。至于说起IL6这个例子就有点搞笑了
，分泌蛋白作为受体那真的是要毁我三观啦。如果把任何可能促进entry的分子都叫做
受体，那么首先要提名的，必然是DMSO了，呵呵 |
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m********m
发帖数: 263 | 34 不知道lz为什么偏好EGCG来抑制adiogensis，有很多东西可以抑制3T3-L1的
differentiation。 如果lz是要问为什么看到EGCG不能抑制adiogensis， 我没用过，
就不知道了. DMSO，FBS都可以稍微诱导adiogensis， lz是不是没有控制好实验 |
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m*******u
发帖数: 173 | 35 Is it a high GC template? If so, add DMSO to enhance the PCR efficiency. |
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H*******i
发帖数: 196 | 36 上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
条件都是
primer F+R 0.5ul 10mM each
A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
dntp 200 μM each
5*HFbuffer 10ul
5%DMSO
60度退火（设计的是68度以上） |
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F*K
发帖数: 608 | 37 多谢楼上各位的回复，原帖是我发的。删了是因为我想重复一下这个实验，以免得浪费
大家的时间。
的确，DMSO， MG132和cycloheximide都是配到了新的培养基里，但是我处理了20个小
时后再收的细胞，新培养基应该问题不大吧？ 谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 这里应该是指用serum free 的培养液来冲调cycloheximide (usually dissolved in
DMSO), 然后再加进原有的培养液里（就是不换液）。在我的经验中这样是可以的，只
要加进去的东西不要超过总体积的20%。
至于说加药到18小时，这个就要赌运气了。在大部分情况下，我不会相信任何超过12个
小时的数据，因为细胞都开始调亡了，谁知道蛋白的变化是什么造成的啊？
对于半衰期特别长的蛋白，标准做法是用同位素标记法。
另外，再多说一句，对于半衰期特别短的蛋白，同位素标记法其实不是一个好方法（除
非是体外转录直接加到反应液体里），因为标记需要至少半个小时到一个小时，其实并
不是一个真正的instant pulse，再加上immune pulldown 本来就不是容易重复的量化
手段（实验的随机误差很大），对于短寿命的蛋白测出来的数值很不可靠。所以这个方
法只对于比较长寿命的蛋白适用。
。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 GC contents of that P2 to AscI site if >65% DMSO 5% to buffer or try
Clontech GC rich kit
Cycle time 35 that is no problem
pls refer
GC-rich PCR concerns DNA templates with high GC content, which is defined as
the percentage of guanine-cytosine base pairs. When amplifying templates
with >60% GC content (i.e 5' ends of most mammalian cDNAs), the three
hydrogen bonds shared by GC pairs lead to enhanced thermostability, which is
problematic for un-optimized Taq polymerase systems.
http://www.clon... 阅读全帖 |
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o*****n
发帖数: 445 | 40 刚看了一下网上资料，好像按1：4加入50%的DMSO，然后缓慢冰冻就可以了。
还有的建议加dextran来降低血液粘度，不过没说怎么用。
有人有建议吗？ |
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a******n
发帖数: 392 | 41 老鼠干细胞可以trypsinize后中和，然后直接加20％DMSO。可是人干细胞不能
trypsinize啊？ |
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i*********0
发帖数: 915 | 42 为什么人的不可以，你做EB assay的时候或者其他的diff assay的时候，就不要单细胞
悬液了么？我做的是小鼠的胚胎干。但是我觉得你可以用小鼠干细胞冷冻的方法，冻人
的干细胞。不过我我们是用20%的Freezing medium。 其实就是20% DMSO, 20% SERUM,
60% DMEM.
LZ可以小规模试试看，然后告诉大家结果呀。 |
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o**d
发帖数: 3080 | 43 DMSO in your PCR system could be help. |
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H*******i
发帖数: 196 | 44 用premier看不出那段会有什么问题。如果实在弄不出来就换个酶，比测试优化条件容
易多了。 Annealing和酶有关，我自己设计的时候引物TM一般都是65+,实际60-
65Annealing，也用过72。没啥大问题，P不出来一般都和模板有关，比如开始部分有个
terminator，超长的reverse complementary序列之类的。
另外我所有PCR都加了5%DMSO，这个有些公司推荐PCR组分里就有。 |
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s******a
发帖数: 472 | 45 这个我不知道，
多大的浓度可以起到HDAC抑制剂的作用？ |
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s******a
发帖数: 472 | 46 我看了一下，文献里说抑制HDAC会促进基因A（Socs３）表达。这样刚好和实验结果相
反。 |
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y******s
发帖数: 92 | 48 PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下，试不出来才怪。
silencing.
认。 |
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y******s
发帖数: 92 | 49 如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。 |
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a*********l
发帖数: 10 | 50 No big concerns if <5%. |
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