t******s
发帖数: 54 | 1 请问有谁知道这个常用的SYBRGreen1 10000x in DMSO 里SYBR Green 1 的浓度吗? 我
想知道如果我从Sybr green 固体自己配的话，应该用什么浓度。多谢。 |
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T*********n
发帖数: 309 | 2 1x SYBR Green I in real-time PCR = 1.96 uM.
Since SG I is sold as 10,000x, a preliminary dilution should be prepared in
DMSO (for greatear stability) before preparing your 10x buffer with 10x SYBR
Green I. Note that most SYBR master mixes contain extra magnesium. |
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t******s
发帖数: 54 | 3 请问有谁知道这个常用的SYBRGreen1 10000x in DMSO 里SYBR Green 1 的浓度吗? 我
想知道如果我从Sybr green 固体自己配的话，应该用什么浓度。多谢。 |
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T*********n
发帖数: 309 | 4 1x SYBR Green I in real-time PCR = 1.96 uM.
Since SG I is sold as 10,000x, a preliminary dilution should be prepared in
DMSO (for greatear stability) before preparing your 10x buffer with 10x SYBR
Green I. Note that most SYBR master mixes contain extra magnesium. |
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s****l
发帖数: 513 | 5 简单的分析hit rate，选top hit的话，用excel就够了（把positive control设置为
100%response， 把你的DMSO(negative control)设置为0%response）。
不过最好联系你做screen的center，他们都有informatic scientist，他们有专业软件
可以做其他的深入分析，你也可以问一下可不可以让你学习使用一下，很多其实蛮简单
的。
教！！！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 6 我的配方是
7mL DMEM+10%FBS+抗生素 (就是常规培养基)
2mL FBS
1mL DMSO
细胞冻存后复苏的时候活细胞太少了。。。。
谢谢！ |
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X*******8
发帖数: 3895 | 7 万能冻存液：15％DMSO (或甘油，可到20％）,20％FBS＋70％基本培养基。要不就买吧
。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 9
万能冻存液：15％DMSO (或甘油，可到20％）,20％FBS＋70％基本培养基。要不就买吧。
你这个跟我的差不多啊。基本培养基是什么都没有的吧？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 11
好吧，我就用个贵的。
搜索了一下看有人用85%的 FBS + 15%的DMSO。 |
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S******9
发帖数: 2837 | 12 95% FBS + 5% DMSO
一年能花几个钱冻细胞啊？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 谢谢楼上各位
我有加了和不加DMSO的对照
也有试过10，20，30，40，50ng template/50 ul reaction
引物有用过Strategen protocol上说的完全互补的
也用过Zhang et al, 2004 Nucleic Acid Research上发表的要不完全overlap的
奇怪的是35个循环出了产物但是都跑well都在胶里
降到18个循环就什么都没有了
但还是转录了，完全没有克隆
重新设计引物什么的18个循环倒是有产物了
但是好多非特异带
只胶纯化8kb的那个带，往下做，没有克隆
想问问大家一般引物终浓度用多少？
PCR条件是根据引物用不同的anealing还是统一用SDM protocol里面的55度，
或者Zhang文章里的52度？ |
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X******n
发帖数: 914 | 15 1. Try Top10 cells
2. Use overlap primers, and use Phusion enzyme, add 3 uL DMSO .
3. annealing at 52-58 degree for 5 circles and increase to 58-62 degree for
19 circles.
4. increase you extension time to 16-20mins. |
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b*******r
发帖数: 18 | 16 8K不算大，12K的质粒经常做，做了无数点突变，很少有做不出来的。做不出来的话，
基本都是酶的问题，不是所有的酶都适合做QC,phusion保真性很好，QC很少能做出来。
我们用的是Vent，很少有做不出来的，还有就是需要家6-8%的DMSO。循环数18-20足够
了，多了也没用。PCR完了之后酶切，直接转化。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 17 感觉要从多肽的性质来分析了。
比如，多肽的溶解性怎么样？是不是需要高浓度的DMSO之类的来溶解，特别是高浓度的
多肽。这溶液中的有机溶剂是不是对多肽和抗原的作用有影响。如果是的化，你这更可
能是溶剂的dose dependent 影响。 |
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s*********y
发帖数: 387 | 18 thanks. no DMSO is used in our system.
All in PBS or water buffer. the solubility of the peptide is very good.
Also, the Biotin-conjugated IgG has the same phenotype, but we can see an
obvious bell shaped curve, for the peptide it is a exponential growth curve,
making the interpretion intriguing... |
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T****i
发帖数: 15191 | 19 可以加DMSO，和一般细胞系一样。不过影响dendritic structure, 尤其dendritic
spine。 |
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e*******e
发帖数: 342 | 20 谢谢，我试了加DMSO，没有改善。不知还有没有别的方法。 |
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C******2
发帖数: 97 | 21 something is wrong with your DMSO. |
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C******2
发帖数: 97 | 22 something is wrong with your DMSO. |
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h*******l
发帖数: 16 | 24 Thank you. I have no idea about the absorbance and florescence. I have no
experience about analytical HPLC. Do I need some standard solutions with
known concentrations when using HPLC? Thanks again. |
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y*****s
发帖数: 1047 | 25 usually RP-HPLC or LC-MS
make the standard curve using a solvent that can dissolve the drug and mix
well with the mobile phase (usually acetonitrile or methanol) |
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d*****r
发帖数: 45 | 26 我们一直用 Stratagene's QuikChange "XL" Mutagenesis Kit 做single mutaion，
最近想试试看别的pfu，发现pfu啊，dNTP啊什么的都可以换掉
但是 stratagene kit里的 "quick solution"还是很有必要加的
说明书里没有写这个buffer成份是什么
google了一下有人猜就是pure DMSO，不知道真的假的
请问有人知道吗？谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 估计是下游有比较古怪的二级结构。建议加大DMSO的量，或者换一个Taq polymerase
knockout |
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c*****u
发帖数: 439 | 28 如果是有非特异的杂带的话
减少 模版 减少 primer 减少dntp 加一点dmso |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 [注]刚才有点生气，所以说话有点尖刻。但是后来我又想，我们这个版上大部分人（尤
其是常驻ID),都是专业人士，不管是支持还是反对这个转Bt protein，都不是什么轮，
所以我把语气改了一下，但如果在我改之前你已经看了的话请原谅我的唐突。
对于你说的这个药用量非常大的说法我感到很惊讶。一个年轻老鼠的平均体重大概在20
克多一些。即使按你说的最大的10mg/g来喂食，那就是每个老鼠喂200mg, 也就是总共
喂0.2g.
这零点二克的蛋白粉是绝对不会让老鼠撑死的，更不会耗尽老鼠的胃酸。一般老鼠每天
最少吃５克固体食物，饮用最少５ml 水。你自己算算看吧。
你说你是做毒理的，这个我倒是觉得你可能犯了一些长期从事毒理工作的人的错误，就
是把protocol 当成圣旨而常常忘记了protocol后面的科学。
比方说你说的那些低毒杀虫剂如果用这个剂量灌给小老鼠会死掉什么的，听得我都忍不
住要笑了。你看来可能根本没有考虑到那些杀虫剂大多数是些芳香基有机小分子吧？这
些化学品如果大剂量的灌进去就直接搞乱了细胞里的水环境，老鼠又不能代谢处理它们
，当然很容易就给整死了，但这个其实和这个化学品的生物毒... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
程度不一样。
如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
没那么大。
对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
新配更
浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
如果你真的有特殊原因要用SYBR，那么建议你直接搬用Taqman buffer（不加probe即可
），然后自己手工加SYBR-green and DMSO, 而不是从头优化Invitrogen buffer.
Ct |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 没啥特别的， 就是把各种东西，包括buffer, dntp, primer,water, sybrgreen, DMSO
, taq
polymerase 都先混合好作为母液，然后分装到管子或者孔里去。最后再把template 加
进每一个管子里，然后离心甩一下。
其实就是把公司的premix 自己装一下。 不知道这个是不是你想问的？ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 32 非常感谢。昨天我根据你的建议，上网查，没有舍得买他们的液体，定了D9891-1g, 看
来我订对了！
他们的液体也是在DMSO里溶的。
既然你们已经可以用水溶，我也用水溶，这样对细胞伤害小些。
水溶的信息很重要。太感谢了！
另外，母液存放的多少度？-20C还是4C？ 谢谢！ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 33 非常感谢。昨天我根据你的建议，上网查，没有舍得买他们的液体，定了D9891-1g, 看
来我订对了！
他们的液体也是在DMSO里溶的。
既然你们已经可以用水溶，我也用水溶，这样对细胞伤害小些。
水溶的信息很重要。太感谢了！
另外，母液存放的多少度？-20C还是4C？ 谢谢！ |
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b******9
发帖数: 102 | 34 1. Gibson assemble,这个就是设计引物的时候两个PCR片段之间（U6 expression
cassette可以分成一个固定的，一个包含 target sequence的可变的），PCR片段和载
体之间要有overlap。
2.ovrelap PCR：两个PCR片段之间有overlap，先单独扩，分别扩增完之后再用Taq酶拼
起来，记得加3%DMSO。回收完了直接连T载体。 |
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x*******t
发帖数: 3764 | 35 加2ul的DMSO试试，或者用GC buffer |
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y*****0
发帖数: 15 | 36 已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
分谢谢！ |
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v**********m
发帖数: 5516 | 37 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 38 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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v**********m
发帖数: 5516 | 39 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 40 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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h***9
发帖数: 662 | 41 老鼠长了个tumor,来不及做flow （to sort tdTomato positive cells),想冻起来以后
再做。有什么注意的？我查了一下，有两个方案：
1.放在cryoprotectant里面， 比如DMSO，冻起来。
2. make single cell suspension, 然后保存在ethanol里面。
另外，以前直接冻在-80度的tissue (没有cryoprotectant) 可不可以拿来做flow?
有没有专家给点建议？谢谢。 |
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发帖数: 1 | 42 ·方舟子·
我以前科普过，宫颈癌基本上都是由人乳头状瘤病毒（HPV）导致的，可以
通过接种HPV疫苗预防。如果已经被HPV感染了，就没有清除HPV的办法，只能等
人体免疫系统自己将其清除。在所有的HPV感染中，大约90%会在两年内痊愈，所
有的病毒都会被清除干净，但是有10%的HPV感染，HPV的基因会结合进细胞的基
因组，成为细胞的一部分，这时候就没法被免疫系统清除，也没有药物能够清除，
只能是定期做宫颈癌筛查，即时发现癌变加以治疗。
有国内医生向我反映，我才知道我真是“孤陋寡闻”，国内早就有了能够清
除HPV的神药，“这个东西现在非常火，火到什么程度？医院的医生只要发现HPV
阳性就开，一次治疗费用几万，效果却并非宣扬的那样好。北京协和郎景和院士
和301医院孟元光为该产品站台，又加上姜世勃姜千人，这个公司靠这个要上市。
协和每个月开3000多支，百万的销量。”不禁引起我的兴趣，这是什么神药，居
然号称能够清除HPV，而且还有大名鼎鼎的协和医院和301医院的大名鼎鼎的妇产
科权威为其站台，让患者不信都不行。
这种神药叫做“抗HPV生物蛋白敷... 阅读全帖 |
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M*******C
发帖数: 183 | 43 过几天要冻存一些T细胞，以前没冻过免疫细胞，网上看到有人用10% DMSO + 90% FBS
， 不用medium。 stem cell公司的人向我推销他们的专业冻存液，但太贵了，最小包
装280刀。你们是怎么冻的？谢谢 |
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p***e
发帖数: 35 | 44 10%DMSO, 90%FBS. 和cell line 一样。 |
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j******n
发帖数: 74 | 46 一个蒽的类似化合物，带酰胺官能团，
走板用 2：1 EA/DCM
或者5% Methanol/DCM
走得都还可以
但是上柱后，前者可能是溶解度问题（估计化合物不溶于DCM，EA，Acetone，溶于DMSO
）只能走下来少量产物
但用后者分，基本在换极性（从DCM换到5%Methanol））产物与杂质一起从前端下来了
，没法分开。
大伙有什么建议？ |
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d*******g
发帖数: 3972 | 48 为啥不慢慢加极性，比如先加1%，然后2%。。。
5%methanol和纯DCM差的有点大吧
DMSO |
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w*s
发帖数: 50 | 50 用DCM/methanol混合溶剂干法上柱. 混合溶剂的溶解能力超乎你的想象, 可与DMSO媲美
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