f*c
发帖数: 2726 | 1 没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
谢谢 |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 人家说了acid，你就老老实实吧做buffer和胶吧。
我好像记得以前用普通的方法也做过，貌似能做出来，不过比较难看。
不是100%确定。 |
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f*c
发帖数: 2726 | 3 人家没说要用acid,我是自己搜，看有人说用acid. |
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s******s
发帖数: 13035 | 4 对呀。那个带正电荷，标准都是acid extract，然后跑urea的胶 |
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A******y
发帖数: 2041 | 5 You don't need acid extraction (do sonicate). I did over 100+ gel on HH3.
It is probably your antibody, the Abcam one (ab1791) is 1/10,000 dilution
against human
HH3. |
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c********b
发帖数: 363 | 6 No need, but I did nuclei enrichment first |
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f*c
发帖数: 2726 | 7 请问你用什么sample buffer? 还有gel running buffer, transfer buffer 有啥特别
的吗
我用abcam另外一个抗体ab18521，好像会弱一些
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A******y
发帖数: 2041 | 8 I use standard in-vitrogen NuPage gel, MES running buffer,transfer buffer at
20% methanol. It is your antibody, I'm also 99% sure. |
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p********i
发帖数: 116 | 9 肯定是抗体的问题，H3在total lysates里很容易检测到。转膜完了，pon.s 染色都能
看到那四条带。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 10 我做过无数的histoneH3, 我们把它当内参，因为小，又特别的好做。每次转膜之后，
把下面的减下来，就可以了。我们western 条件就是最最standard的。每次信号都特别
强。你肯定是没有sonicate你的lysate。 |
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m*******e
发帖数: 90 | 11 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高. |
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t****t
发帖数: 86 | 12 I endorse this message. |
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A******y
发帖数: 2041 | 15 There are some horrible HH3 antibody...trust me...almost ten year experience.
nuclear |
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a*******a
发帖数: 4233 | 16 不用，直接细胞裂解煮10分钟去上样
我的条件是.45nc膜300毫安45分钟
做了6年组蛋白修饰的爬过
要是用ripa extract估计是拿不到 |
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f*c
发帖数: 2726 | 17 做出来了，把transfer 电压时间都下降了。
谢谢大家 |
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t****y
发帖数: 168 | 18 这也很奇怪。一直和楼主一样转的。永远有带。而且丽春红染色就看的到。
除非有两种可能就是1 楼主用某些商业化的裂解液，太温和了，核根本没有破。
另外就是 转膜的时候没有转上17kd的带。 |
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f*c
发帖数: 2726 | 20 也不能说exactly the same condition, 把样品狠狠地vortex 了几次，transfer电压
下降了，只前用的电压都比较高，然后transfer buffer里去掉了SDS （我们之前
transfer buffer is same as running buffer）,最后反正是whole cell lysate有带
了，信号还挺强，到底是哪个起了作用也不知道。 |
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d****7
发帖数: 109 | 22 在ChIP-seq里，这俩一直都很火啊，尤其是CTCF，感觉仅次于histone和pol II
我对Jussi Taipale那篇文章很无语。。。。。。
seq |
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l**********1
发帖数: 5204 | 23 key words:
5fC; 5 caC; pre-mRNA splicing; Pol II; hetrochromatin or H4K20
cited from
Nat Struct Mol Biol. 19: 1061-4. (2012).
New functions for DNA modifications by TET-JBP.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23132381
>the ability of 5fC and 5caC to decrease the transcription elongation rate
of Pol >II may facilitate the interaction of Pol II with diverse
transcription elongation factors, chromatin regulators, histone-modifying
enzymes and factors involved in pre-mRNA splicing. Shukla et al.34... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 4671 | 24 听说过 histone mRNA 靠 stem-loop 而不是 poly-A tail。
neo- |
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A**r
发帖数: 43 | 26 你的意思是，这个蛋白在depolarization之后会被recruit到Arc和Fos的promoter，
但是敲掉之后，Arc和Fos的mRNA level没有变化？
有没有类似功能的蛋白可能compensate你的manipulation？
除了ChIP data之外，还有什么证据支持“认为它可以调节neuronal activity
dependent gene expression”？
这个蛋白是DNA-binding或者histone-binding么？跟transcription factor有关？ |
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c****1
发帖数: 1095 | 27 你的理解是正确的。
把它同一个家族的其它基因同时敲掉后，也没有什么变化。这个蛋白是可以跟histone
结合的。目前只有ChIP data是阳性的。我们也考虑过这个蛋白的作用可能是先跟
promoter结合但是起的作用是及时关掉相关基因的表达。但是实验结果也不是很显著。
我的问题是，研究activity dependent gene expression，除了可以从开始induction
和后期的 shut down入手外，还有没有别的路径可以考虑？ |
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A**r
发帖数: 43 | 28 不知道。。。只能瞎猜了
敲掉这个基因会不会影响histone modification？
如果还是从induction的角度的话，
有没有可能是KCl depolarization的刺激太强了，掩盖了一些细微的变化？没准用
physiology level的stimulation，能看到induction的不同？
有没有可能影响induction的快慢？Arc和c-Fos在几分钟之内就产生mRNA，敲掉这个基
因之后，没准induction变慢了（前十几分钟的mRNA变少），但是一个小时之后测mRNA
，可能看不出啥变化。 |
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l****y
发帖数: 398 | 29 I have seen ser/thr acetylation on e.coli expressed recombinant histone once
. It was actually surprisingly abundant (~5%).
It could be modified by e.coli enzymes or in vitro by acetic acid or some
chemicals during sample processing. |
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m******g
发帖数: 467 | 32 Science 14.01.03
新年快乐！P.S. 这周又没有遇到“推荐”的paper。
稍微了解一下：
1. Two Y Genes Can Replace the Entire Y Chromosome for Assisted Reproduction
in the Mouse
另外，
complex and multilayered palindromic structure of the Y chromosome
may facilitate internal pairing of nucleotide bases
2. Break-Induced Replication Repair of Damaged Forks Induces Genomic
Duplications in Human Cells
小知识：
1. A Cascade of Histone Modifications Induces Chromatin Condensation in
Mitosis
2. A Neural Mechanism Underlying Mating Preference... 阅读全帖 |
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m******g
发帖数: 467 | 33 Science 14.01.03
新年快乐！P.S. 这周又没有遇到“推荐”的paper。
稍微了解一下：
1. Two Y Genes Can Replace the Entire Y Chromosome for Assisted Reproduction
in the Mouse
另外，
complex and multilayered palindromic structure of the Y chromosome
may facilitate internal pairing of nucleotide bases
2. Break-Induced Replication Repair of Damaged Forks Induces Genomic
Duplications in Human Cells
小知识：
1. A Cascade of Histone Modifications Induces Chromatin Condensation in
Mitosis
2. A Neural Mechanism Underlying Mating Preference... 阅读全帖 |
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j***x
发帖数: 1469 | 34 J Biol Chem. 2013 Jun 14;288(24):17895-907. doi: 10.1074/jbc.M113.452144.
Epub 2013 May 3.
Developmentally regulated linker histone H1c promotes heterochromatin
condensation and mediates structural integrity of rod photoreceptors in
mouse retina.
Popova EY, Grigoryev SA, Fan Y, Skoultchi AI, Zhang SS, Barnstable CJ.
Source
Department of Neural and Behavioral Sciences, Pennsylvania State University
College of Medicine, Hershey, Pennsylvania 17033, USA.
l************[email protected]
thanks! |
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t********n
发帖数: 64 | 37 Genome Analyses of Single Human Oocytes
Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a
Single Human Cell
Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by Whole-
Genome Sequencing
Rare event of histone demethylation can initiate singular gene expression of
olfactory receptors
这是为了欢度圣诞么。。太霸道了 |
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n******2
发帖数: 971 | 38 实验要检测目标蛋白在特定DNA区的结合；用histone H3抗体作阳性对照，IgG作阴性对
照；磁珠beads。发现在裂解液中加入beads-抗体后，beads会有不同程度的粘结.总体
趋势是H3〉目标蛋白〉IgG。 其中IgG-beads几乎没有粘结的现象。这个观察可以理解
为不同抗体富集蛋白的能力和总量不同，H3最强，IgG最弱。这种粘集在不同的wash
buffer处理时，没什么改变，但是当最后用TE洗的时候却一下子消失了。似乎TE破坏了
蛋白之间的相互作用使beads变得不再粘连了。
问题是TE中并没有什么特别的成分，除了不包括detergent和LiCl，Tris和EDTA的浓度
和最后的wash buffer相同。PH值TE:7.99；wash buffer:8.14也没大区别。
请同学们指教一下，为什么加了TE后，beads不再粘连了？这种现象是否暗示有蛋白产
量上的损失？以及最后一步如果省略在wash buffer 1,2,3后用TE洗beads会有什么结果？
多谢了。 |
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E*****e
发帖数: 54 | 39 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 40 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
核内部，所以包不起来。
至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
含有SV40 复制起点的质粒。 |
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T****u
发帖数: 424 | 41 我很负责地告诉你，是有nucleosome的
很久很久之前，我做的一个实验就是把质粒转进，再提出来，能看到漂亮的nucleosome
packing. |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 有点不太明白的问一下，是用普通的环状质粒，lipid-based 方法转进去的，还是用切
断过的线状碎片，用电转进去的？如果用环状，也能包装么？
nucleosome |
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j****x
发帖数: 1704 | 44 这里我倒是还知道一个“唯二”的特例：
如果在哺乳动物表达质粒的转录单位后面接上一段nuclear scaffold matrix
attached region（SMAR序列），那么该质粒就可以在不需要真核复制起始位点的情况
下以episome的形式存在并跟随基因组染色体在细胞分裂的过程中自我复制无需任何其
他条件。这种情况下的组蛋白的结合和修饰都是存在的，但有其特殊性。 |
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c********b
发帖数: 363 | 46 环状质粒进入植物细胞核是通过importin4 alpha介导的，这是已知的。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 47 大于300bp的质粒入核需要跨越核膜的屏障，简单说来，可能存在2种“常见”机制，尽
管实际情况会复杂的多。
1. 对于dividing cells，细胞分裂过程中核膜解体，质粒得以进入核内，这属于“
passive nuclear importation”，没什么疑问。
2. 对于non-dividing cells，NPC介导的active transport则是可能的主要途径。这其
中plasmid上面的sequence-specific element以及某些host facotor都是必要的条件。
这一块的具体机制似乎还不是完全清楚，但有证据表明，这一途径存在明显的sequence
-dependent以及transcription-dependent的特性。 |
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h***l
发帖数: 168 | 48 This is relevant -- Howard Cedar papers -
plasmids injected to nuclei are differentially packaged during early vs.
late S-phase. |
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s******y
发帖数: 28562 | 49 大部分质粒，其实都是要等细胞分裂的时候趁机进入核的。
所以大部分质粒转录需要细胞有分裂过程。如果细胞根本不分裂，那么质粒上的蛋白就
基本上没有办法表达。
某些病毒的DNA除外, 他们有办法在非分裂期进入核。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 50 如果不是注射进去的呢？比方说一般转录进去的会怎么样？
我对这个方面挺好奇的。 |
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