O******e
发帖数: 4845 | 1 质粒肯定是要进核的，否则转录如何完成？你想想，我们用的过表达的载体，是必需经过
转录这一步的。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 2 你说趁机入核，也就是随机被细胞核包括进去？这个跟我理解的通过nuclear pore进核
出入挺大的。有什么依据么？补补课。。。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 3 plasmid在非分裂期通过NPC入核当然是可能的，但是需要特定的DNA序列支持，比如
SV40 ori或者NLS bingding sequence的存在，importin介导的质粒入核不是无条件的
，这点已经非常明确了。真核表达质粒往往都会包含这些sequence element,所以会让
人产生错觉，觉得是理所应当的，其实不然。
- |
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s********x
发帖数: 472 | 5 一些virus的dna 序列是帮助质粒入核的. 但是有没有人知道是那段序列？比如常见的
pcdna系列vector. |
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j******i
发帖数: 939 | 6 你确定有这样的dna序列? 我知道，hiv可以感染不分裂的细胞，因为能形成dna-
protein复合体，帮助进入细胞核。单独的一段dna序列恐怕不够吧？
蛋白进入细胞核倒是只要加NLS序列就好。
另外，plasmid用transfection 还是nucleofection 入核机理是不同的。后者，跟细胞
骨架有关。前者，一般认为是随细胞分裂人核的。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 7 前面提到过几次了，质粒上带有的SV40 ori就可以介导入核，或者带有NLS binding
seq也可以。
外事不决问google |
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j******i
发帖数: 939 | 8 google一下，确实是有。很奇怪，有人在做这些。另外一些，却做相反的事情－把多余
的序列都去掉，只留下expression cassette 来产生minicircle DNA, 表达效果却比普
通的plasmid好很多。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 9 在非分裂细胞的上效果未必会那么好了
也有研究表明，转录活跃的质粒更容易入核，如果抑制转录，则入核效率极大降低。提
示DNA和转录因子的结合可能在入核过程中有重要的作用。
不过这一块好像没什么系统性的研究，到现在也还是半清不楚的 |
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j******i
发帖数: 939 | 10 SBI关于他家minicircle DNA描述：
'For dividing cells, expression of the minicircles lasts up to 14 days. For
non-dividing cells, expression of the minicircles drops slightly after the
first week, but then can continue expressing the transgenes for months.'
可能入核跟size也有关系。minicircle DNA小，更容易进入细胞核。 |
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b********g
发帖数: 46 | 11
nucleosome
请问，如何把这种质粒提取出来的？用什么方法看到nucleosome packing ? |
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 为什么这个能表达14天？这不是意味着我不用作稳定转染了？
For |
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l********e
发帖数: 415 | 15 如前面版友所说，很多都在intron，不一定要upstream
一般情况下，看看TSS(transcription start site)前后20-50kb就差不多了。
结合evolutionary conservation和histone marks看。
题外话：
染色体间的转录调控，这个假说的确是存在的，不过好像还没有很充分的证据。 |
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D***0
发帖数: 5214 | 16 另外记得作strand specific library。size selection, polya+还是polya-, 看看文
献好好想想。另，RNAseq有个毛病是，即使存在某个转录，如果表达量低，很难被测序
仪读出来。建议LZ，通过别的证据，比如histone marks（这是lncRNA 发现背后的关键
因素），coding frame，已有注释等信息先确定candidate。然后设计引物把它P出来。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2 |
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k*****n
发帖数: 323 | 17 e.g.
Goldberg ML. 1979. PhD Thesis. Sequence analysis of Drosophila histone genes
. Stanford, CA: Stanford
University. |
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l*******i
发帖数: 153 | 18 有意思。
是female mESC吗？是的话，先做两个实验：
1）H3K27me3 immunostaing：可能发现small dot in nucleus.
2)qRT-PCR测Xist的表达，或者用FISH。
证实的话，就说明出现X chormosome inactivation了。
几个问题：
3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
大新意取决于你的这个gene
2）看一下这个基因的功能，是否已有先关报道，与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA? |
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i*********0
发帖数: 915 | 19 我明天确认一下是不是female 的ESCs。
对于其他的问题：
几个问题：
3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
serum + LIF的培养条件
1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
大新意取决于你的这个gene
如果要看Oct4等gene的表达的话，RNA 水平上看到降低，Protein水平上有20%左右的降
低。但是这些pluripotency的gene在蛋白水平还维持在一个高的状态。
2）看一下这个基因的功能，是否已有先关报道，与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA?
该gene目前的功能还不清楚。另外，我看到Xist gene在shRNA处理想样品中，在RNA水
平上有3倍数的降低。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 20 High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics
in human cells
Yuexin Zhou, Shiyou Zhu, Changzu Cai, Pengfei Yuan, Chunmei
Li, Yanyi Huang & Wensheng Wei
ZMYND11 links histone H3.3K36me3 to transcription elongation and tumour
suppression
Hong Wen, Yuanyuan Li, Yuanxin Xi, Shiming Jiang, Sabrina
Stratton, Danni Peng, Kaori Tanaka, Yongfeng Ren, Zheng Xia,
Jun Wu, Bing Li, Michelle C. Barton, Wei Li... 阅读全帖 |
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A******y
发帖数: 2041 | 21 Good basic research with potential application. They are knowledge but the
return might not be immediate. Although, I do believe the HDAC/SIRT field
need to move away from histones. |
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m******5
发帖数: 1383 | 23 目的蛋白是个transcription factor，表达很低。
看了不少Chip protocol，似乎stringency都很高，貌似都是给 histon之类表达量高的
蛋白用的，有同修接触过类似情况么? |
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r******k
发帖数: 446 | 24 就跟histone methylation， we need time to accumulate. |
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A******y
发帖数: 2041 | 25 You mean DNA methylation. Histone methylation is more dynamic... |
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t**l
发帖数: 109 | 26 我的建议是下次用2%或者5%的input。
做TF的CHIP本身就是很难。你的TFbinding确实很低，所以你需要做一个IgG control,
或者NO AB CONTROL。
还有你现在这种比较方法不是很科学，因为你在比较2个SAMPLE出来的DNA。 每个
SAMPLE 的handling都会造成很大的误差，所以你需要normalize到一个control DNA
region.
1/9*1/(2^6)
which is extremely low.
这个数值你现在show的其实没有任何意义，你这个数值如果跟SAMPLE B比较，其实很高
，但是不能证明这个TF就bind这个地方。
你需要screen其他的region在SAMPLE A里面, 如果你其他的region出来的都是1/9*1/(2
^6) 这个值，那么说明你这个值没有任何意义。
CHIP绝对值的YIELD比较没有什么意义，不同人做CHIP的方法不同，你可以用histone
H3 antibody做个CHIP，看看yield。
最完美的CHIP是这种
有IGG control,有KO CELL LINE contro... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 27 另外，我觉得晶体结构有时候是有误导，或者说片面的。就说双螺旋吧，只有在原核生
物里是线性的。在真核生物in vivo的情况下，大部分时候DNA都是有histone
chaperone包裹着。双螺旋反应不了高级结构 |
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m******g
发帖数: 467 | 30 PNAS 14.08.19
推荐：
1. Different tradeoffs result from alternate genetic adaptations to a common
environment
稍微了解一下：
1. Pervasive domestication of defective prophages by bacteria
小知识：
1. Artificial selection for structural color on butterfly wings and
comparison with natural evolution
2. Short sequences can efficiently recruit histone H3 lysine 27
trimethylation in the absence of enhancer activity and DNA methylation |
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m******g
发帖数: 467 | 31 PNAS 14.08.19
推荐：
1. Different tradeoffs result from alternate genetic adaptations to a common
environment
稍微了解一下：
1. Pervasive domestication of defective prophages by bacteria
小知识：
1. Artificial selection for structural color on butterfly wings and
comparison with natural evolution
2. Short sequences can efficiently recruit histone H3 lysine 27
trimethylation in the absence of enhancer activity and DNA methylation |
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m******g
发帖数: 467 | 32 Nature 14.12.11
小知识：
1. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in
single living cells |
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D***a
发帖数: 516 | 33 抗体太好用了吧。减少上样量，增加抗体稀释倍数。 |
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r******k
发帖数: 446 | 34 好吧!我就上了15ug。。。。。应该不多吧？ 我要不dilute一下抗体？ |
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D***a
发帖数: 516 | 35 上样量也减少到1/10吧，要不也是肥肥的条带。 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 36 circular RNA/lncRNA;super enhancer;各种histone modifiers;Wnt in (cancer)
stem cells;IDH in (cancer) metabolism;hedgehog signaling等。 |
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V******t
发帖数: 444 | 37 对 enhancer绝对是热门 IDH也热门
histone modifier过气了吧？
求问为啥wnt 和 hedgehog signaling 依然重要？不是已经研究得很清楚的pathway了咩 |
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A******y
发帖数: 2041 | 38 Yes, histone modification is old hat. However, lysine modifications just
beginning on several key regulatory pathways (hint: not acetylation nor
methylation).
了咩 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 39 （仅限于对cancer的了解）histone modification/mutation/variant在cancer领域还
是很热的吧。Wnt仍然是热点信号通路，还有很多方面没有研究清楚，比如Wnt的细胞外
delivery和b-catenin转运，很容易上CNS的哦。
了咩 |
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f******g
发帖数: 1003 | 40 Early life stress in fathers improves behavioural flexibility in their
offspring
Nature Comm.
Traumatic experiences in childhood can alter behavioural responses and
increase the risk for psychopathologies across life, not only in the exposed
individuals but also in their progeny. In some conditions, such experiences
can however be beneficial and facilitate the appraisal of adverse
environments later in life. Here we expose newborn mice to unpredictable
maternal separation combined with unpredict... 阅读全帖 |
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b**********a
发帖数: 930 | 41 楼主说的对，现在的化合物库和化合物设计、合成、in vitro筛选等都不是瓶颈，in
vitro筛选的效力惊人，只要有足够的化合物，in vitro活性都可以得到。
真正的瓶颈在in vivo筛选，这里面的最大问题的动物模型，现在最常用的是大鼠和小
鼠。这些动物in vivo和人类的相关性、预测性等完全没有办法，动物模型本身的病理
状态和人疾病的相关性等。如果哪一天猴子模型可以很普遍的应用，可能这些预测性和
相关性会好很多。
《PNAS》最近提到的生命科学类11月最受关注的十篇论文中提到小鼠模型须小心使用，http://www.biomart.cn/news/103/129225.htm
小鼠被广泛用于模拟人类代谢、疾病和药物应答，是医学研究中的一个基本工具。然而
斯坦福大学的研究指出，人类和小鼠的基因表达存在着惊人的差异，不论是蛋白编码基
因还是非编码基因。这项研究发表在十一月十七日的美国国家科学院院刊PNAS杂志上。
相信在未来的不久对大鼠基因表达也会有类似的研究，这样应该可以比较好的解释为什
么动物模型的相关性和预测性是如此之差。
小鼠被广泛用于模拟人类代谢、疾病和药物应答，是医... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 42 看帖要仔细哈，我可没说永生链比较成熟哈，永生链属于争议很大的，但对称不对称分
离应该说比较成熟了，对吧？就永生链而言，个人而言我比较OPEN-minded，觉得自然
也有这种潜力哈，目前在多个系统有报道，也不仅仅是用ＢＲＤＵ，也多个系统被否决
；而且同一个实验室在不同系统报道不同也存在（好像是SM实验室）；ＲＡＮＤＯ和另
外一个多伦多大学的学者３年前在ＣＥＬＬ上背靠背有一个ＰＵＫＥ，一个推崇，一个
title直接就是：IMMORTAL strand: give me a break。我个人比较喜欢RANDO，对他的
人有一些了解，研究那是非常了解，差点还去了他实验室做博后；RANDO应该是这个领
域顶尖的人物了，MD出生，很SHARP有VISIOn系统和深度的研究者，尽管也会忽悠哈，
工作我个人还是比较喜欢的
....anyway 如果IMS存在，可能机制是什么，估计表观遗传和细胞质分离参与的可能
性都比较大，而这方面都有不对称分离的工作和依据了，UM的日本学者和SKCC的华人新
秀SHS都有相关方面的报道，中心体的分离成熟，表观的HISTONE的半保留复制等，去年
同SH吃饭，我... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 43 Yukiko和Xin好像都是M. Fuller实验室出来的，都是以果蝇germline stem cell为模型
做，她们两个人合作很密切。
Yukiko主要做GSC中心体对Asymmetric division的影响。她也用Brdu标记(之后用某种
酶降解template strand)看染色体在是不是优先分配到stem cell里，具体文章我没仔
细读过。
Xin是做histone不对称遗传的，前两年发了篇Science报告现象, 现在在接着做机制，
具体的就不说了哈。
XIN |
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y*********u
发帖数: 183 | 44 前辈你做的Chip-SEQ都是基于什么的？histon还是transcription factor？ |
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M********a
发帖数: 35 | 45 哈哈，别喊前辈。
都不是，但是类似Histone. |
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h********1
发帖数: 157 | 47 关键是要细胞在分裂期才会有一条条的染色体，否则就是染色质，哪能分得开呀。建议
细胞处于分裂活跃期的时候收细胞，不能太满。另外trypsin时间不要太长，收那些很
快就dissociate的细胞 |
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R****n
发帖数: 708 | 48 "细胞处于分裂活跃期的时候收细胞，不能太满"
20-30% confluence?
"另外trypsin时间不要太长，收那些很快就dissociate的细胞"
这个是什么原因啊？
谢谢 |
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s******s
发帖数: 13035 | 49 他的意思大概是70%一下。另外，分裂期的细胞接近球形，attach的面积小，容易下来 |
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R****n
发帖数: 708 | 50 基本上是这样的。似乎要先计算contact map,然后算一下这个蛋白和和几个histone
variant的affinity，我不知道其他还能做些什么。
您能不能写个稍微详细点的pipeline？ 读博士的时候学过一点Pymol,现在估计都忘光
了。
还有几个技术问题：
1）这个蛋白是DNA binding,RCSB上的结晶是施一公做的，那个上边有dsDNA。计算的是
应该去掉dsDNA吧，怎么去掉？
2）这个蛋白和nucleosome wrapping DNA的结合能力，应该需要半放松的DNA双链。
nucleosome的结晶数据是结合比较紧密的。计算怎么模拟？
interface |
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