v********a
发帖数: 646 | 1 请问大家都是怎样从96孔～12孔板上收获细胞，用来裂解做WB?
不考虑靶蛋白的丰度，一般24孔板用多少微升裂解液裂解，并从中取多少跑SDS-PAGE?
Thanks. |
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v********a
发帖数: 646 | 2 把不同的蛋白样品定量后，load相同量的蛋白样品做Western Blotting，但是出来结果
，总是出现loading control 的量并不一致，有的多，有的少。非常苦恼。
请问：如何能作出loading control 一致的Western Blotting？
知道这个问题很low，但乡下人就是这么菜。恳请达人指教诀窍：怎样处理组织或者细
胞样品，从而使SDS-PAGE上样量一致？谢谢。
我的方法：
细胞或组织用RIPA裂解
超声3次，15s on/15s off
离心12000rpm，取上清
将上清做2x梯度稀释，然后用bca kit测定浓度
取相同量的蛋白跑page
转膜，wb |
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v******0
发帖数: 265 | 3 有个关于SDS-PAGE的问题想请教大家。
大部分protocol上都是先分离蛋白，然后每个gel band再做DTT还原和alkylation，这
样的话就需要每个band单独做这两步，如果band很多，就很花时间。
请问为什么大家不在gel上分离之前就一次做完DTT还原和alkylation呢？理论上应该一
回事啊，但这样分离完就可以直接digest了，应该省很多时间啊？
请大家指教一下 |
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g******y
发帖数: 2517 | 4 Bosch 11224VSR 7/8-Inch SDS-Plus Bulldog Rotary Hammer, 59% Off, Amazon
Lightning Deal
http://amzn.to/yDWLXX |
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g******0
发帖数: 1165 | 8 光腚是不是屁股露出来的意思？光屁股。。。。
屁股都露出来 还怕毛露出来么
明天跌过今天的最低点就CUT （DRV）
SDS 可以保留
DRV 太烫手 |
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M*****g
发帖数: 3145 | 9 是啊，一旦方向错了，完蛋的很快。
不过，sds要比srs平缓多了。 |
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c***t
发帖数: 383 | 10 ☆─────────────────────────────────────☆
withourcar (注意不是老ｉｄ＂没有车＂) 于 (Wed May 1 10:30:55 2013, 美东) 提到:
看水军疯狂的表现就知道了。
有句话讲，欲令其灭亡，必令其疯狂。
可见SW是真怕了。 知道离上刑场不远了。 趁现在赶紧发出最后的哀嚎。
另外，
如果孙维真是无辜的， 为什么公安部不能公布案情？ 一个普通的犯罪案件，有什么
可神秘的？ 为什么党中央下发文件，说此事涉及到稳定大局？ 没有涉及到高层能影
响大局吗？
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logic98 (logic) 于 (Wed May 1 10:34:48 2013, 美东) 提到:
我希望你，或者其他坚信孙维是凶手的讲出点干货，说服那些还不相信孙是凶手的支持
你们的观点，不要光会骂人或者扯些没用的东西。
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nimonimo (隔世追铊) 于 (Wed May 1 10... 阅读全帖 |
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y**s
发帖数: 563 | 11 当太太擅自停服抑郁药物后
太太认识了一个朋友，她说停了抑郁药，病好了（我并不认同）。太太在她的影响
下擅自停服抑郁药物. 头几天非常高兴，心想：终于摆脱了万恶的药物。没几天，身体
出现疼痛，到医院检查去了，做了一些理疗,对我的态度也明显不对。再过几天，到处
去哭诉。叫她服抑郁药物她不服。
我好不容易叫她试一试下面量表---６３分(中度抑郁)，我说不吃
药是你受罪，不是我受最罪。你不吃药，我不管了（太太已４次擅自停服抑郁药物）,
每次都是同样的结果。第二天她去看了心理咨询师，心理咨询师也说她不应擅自停
药.有了SDS量表后，她再也没有擅自停服抑郁药物了。所以我推荐SDS量表给大家。
这个量表我在网上找的，作了一些完善,添补了中国常模,希望对大家有用。
“抑郁自评量表(SDS)”
这是一个含有20个项目,分为4级评分的自评量表。其特点是使用简便,能相当直
观地反映抑郁病人的主观感受。
（1）项目、定义和评分标准
SDS采用4级评分，主要评定症状出现的频度，该4级的记分标准为：没有或很少时间（
为1分）；小部分时间（为2分）；相当多时间（为3分）；绝大... 阅读全帖 |
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y**s
发帖数: 563 | 12 当太太擅自停服抑郁药物后
太太认识了一个朋友，她说停了抑郁药，病好了（我并不认同）。太太在她的影响
下擅自停服抑郁药物.头几天非常高兴，心想：终于摆脱了万恶的药物。没几天，身体
出现疼，到医院检查去了，做了一些理疗。对我的态度也明显不对。过几天，到处去哭
诉。叫她服抑郁药物她不服。我叫她试一试下面量表---６３分(中度抑郁)，我说不吃
药是你受罪，不是我受最罪。你不吃药，我不管了（太太已４次擅自停服抑郁药物）,
每次都是同样的结果。有了这个量表后，她再也没有擅自停服抑郁药物了。所以我推荐
SDS量表给大家。我在网上找的，作了一些完善,添补了中国常模。希望对大家有用。
“抑郁自评量表(SDS)”
这是一个含有20个项目,分为4级评分的自评量表。其特点是使用简便,能相当直
观地反映抑郁病人的主观感受。
（1）项目、定义和评分标准
SDS采用4级评分，主要评定症状出现的频度，该4级的记分标准为：没有或很少时间（
为1分）；小部分时间（为2分）；相当多时间（为3分）；绝大部分或全部时间（为4分
）。以下是SDS量表
填表注意事项:下面有二十条文字，请仔细阅读每一条,把意... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 13 ☆─────────────────────────────────────☆
netchen (无) 于 (Sun Apr 28 20:35:36 2013, 美东) 提到:
第一条你怎么想出来的，说说有没有以前类似的成功的例子？
第二条，你也太娱乐了，她要测谎，就所明她不怕。她已经把自己潜意识里面的羞耻感
彻底消除了。
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midway64 (中途岛) 于 (Sun Apr 28 21:11:42 2013, 美东) 提到:
第二条看来你真反对呀。你们正义党也分裂呀？不是那么多人说集体作案吗？不是铊党
洗地党吗？感情你是和我一伙的！支持罪犯可能只有一个，不要误伤无辜，属于洗地党
的。 误会误会。
你的意思孙维测谎肯定过了，其他人测也白测？我倒不同意，没准儿测孙维一个就真相
大白呢。你把孙维也太神化了，感情比我还蜜。
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JACSandPRL (没有) 于 (Sun Apr 28 22:38:04 2... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 14 ☆─────────────────────────────────────☆
sgwe00 (sds) 于 (Thu May 2 16:49:00 2013, 美东) 提到:
摘几条留言啊：
孙释颜，（jasmine sun），原名孙维，94年清华朱令铊中毒案的唯一嫌疑人，案子至
今疑点重重，同时，该人以及其配偶谢飞宇（feiyu xie）涉嫌向美递交虚假个人材料
，上报虚假个人财产信息，逃税瞒报，希望美移民局不要轻易让该类危险人入籍 (今天
00:18)
美国收留中国刑事罪案嫌疑人孙维（现改名孙释颜），任其改换身份而失察， 非民主
自由国家所为！此举将给贵国公民人身安全及利益带来极大潜在威胁！美国收留中国刑
事罪案嫌疑人孙维（现改名孙释颜），任其改换身份而失察， 非民主自由国家所为！
此举将给贵国公民人身安全及利益带来极大潜在威胁！ (今天 00:06)
美国使馆难道一点儿都不重视“朱令”“孙维（孙释颜）”一案吗？难道美国希望中国
所有的罪犯都逃到美国吗？ (5月2日 22:56)
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s... 阅读全帖 |
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w*******y
发帖数: 60932 | 15 I've been looking for a Bosch Demo Hammer for awhile and trying to find the
right combo of size/power/price that I want. I have a 64lb Brute, but need
something in the handheld range for more delicate breaking. Additionally, I
'd like the capability of drilling some larger holes (than a 1" Makita
Rotary I have can do), but am stuck between going with a strictly demo
hammer (such as the 11316evs) or going with a combo (such as a 11264evs).
This morning I happened to be looking at CPO Bosch's si... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 16 ☆─────────────────────────────────────☆
sgwe00 (sds) 于 (Fri May 3 12:14:40 2013, 美东) 提到:
刚看到的好消， 到国土安全局举报薛刚，他包庇投毒嫌疑人！太高兴了！ 终于打通了
国土安全局的举报电话，详细告知铊作为投毒案主要嫌疑人可能有的移民意图。告知了
国土安全局铊用的几个名字和铊夫的名字，铊夫的移民状况，和他们可能假离婚。留了
本人姓名电话供国土安全局进一步询问时用。北美筒子们，经几天拨打，发现向国土安
全局举报时这个电话更好用：202-282-8000
这个电话一直有接线员接听，不像另一个免费电话总是没人接。接通后，请求转到举报
热线(Please transfer me to the tip line. ) 然后有巨长的选择菜单，要仔细听。
先选1（新案及旧案举报），然后又是巨长的选择菜单，我好像选的4. 然后有真人接听
，您就可以娓娓道来了。
另外youtube上关于朱令案的网址，请大家打开看，增加流量，一定要看完啊，否则不
算点击率,点击量高了就会推到首页，希望每个人都能伸出援手，我... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 17 ☆─────────────────────────────────────☆
ABX (Anti-Bio-tiX) 于 (Wed May 1 12:50:01 2013, 美东) 提到:
达不到中国的水平， 凑合达到美国的水平了。
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wutongtian (梧桐天) 于 (Wed May 1 13:10:06 2013, 美东) 提到:
十一公是谁。。。？
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kan (look) 于 (Wed May 1 13:16:24 2013, 美东) 提到:
美国 who cares 科学院士? 忘了，老中们 care。
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zQz (zzz~~~) 于 (Wed May 1 13:22:06 2013, 美东) 提到:
祝贺
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W... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 18 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
Kd的酶).
我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
dilution的比例和体积.
Good luck. 用的高兴分我几个包子.
Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
- Culture the E. coli overnight
- Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
4hrs
- Pellet the E. coli at 6000 rpm at 4 degree
- R... 阅读全帖 |
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d********n
发帖数: 15 | 19 it's not degradation (proteases work less efficiently at ~90C, but will be a
disaster at ~55C at which proteases have reduced activity but protein
substrates begin to open structure and give much higher accessibility), but
precipitation because proteins lose native structure under heating. This is
why SDS or LDS loading bf needs to be added before heating. 1g sds binds to
14g proteins, 10ul sds loading bf is supposed to be enough wrap all proteins
in
the sample as they are so low.
the only probl... 阅读全帖 |
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a****a
发帖数: 27 | 20 Thank you very much for your information and suggestions. Yes, SDS is more of
interest test than MBTI. Do you think it is better to use SDS if I am going to
conduct survey among Chinese college students? SDS is well established here in
the US and many universities use it to assist students in their major choosing
and job hunting. The interpretation of a SDS test makes a lot of sense to
those who are struggling with choices. However, the question is: How can I
make use of the SDS report if I am g |
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HQ
发帖数: 19201 | 21 哈哈，你这个垃圾又来了，跟着我咬了好几年了，你敢不承认？
很奇怪的是，你这种垃圾，为什么喜欢编造谎言来攻击别人呢？
我当时只买卖过sds一次，而且是很少一点。
02/26/2009 10:56:13 Bought 50 SDS @ 88.58 -4,434.00 ---
03/03/2009 13:23:15 Sold 50 SDS @ 108.0906 5,399.49 ---
这是我2009年2月到5月唯一的一次sds操作
显然你又要找别的或者装看不见了 |
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d*****1
发帖数: 8618 | 22 补仓了4000股sds 一共10000 现在1/3仓位都是sds了 剩下2/3 cash
暂时不打算买了 躺着装死
如果SPY到220-225 应该会看情况再买入10000 sds
如果SPY继续上涨到230-240 应该会看情况再买入最后10000 sds
然后躺下静静等死 |
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c***t
发帖数: 383 | 23 ☆─────────────────────────────────────☆
nimonimo (隔世追铊) 于 (Sun Apr 28 13:22:05 2013, 美东) 提到:
zt from tianya
天涯高楼
http://bbs.tianya.cn/post-funinfo-4092499-1394.shtml
今日已进入此案发酵第十天，部分ID关注度降低，我可以理解，
大家各自都有自己的生活。
我只想说，我仅代表自己，坚持这场战争。无论一月，一年，十年，我将坚持下去！
即使同行路上，只剩下贝志诚！
即使司法审判最终不出面，我也用民意的力量，
让全世界有华人的地方，都变成孙维薛潘的监狱。
所有倦了累了的同志们，
你们终于体会到朱妈妈，吴爸爸二十年来的心情了吧？
上无告诉之门，下无爱女康复之希望，
我们倦了累了，那他们么？他们二十年连个“倦”都不敢想！！！
可不可以不要放弃，可不可以坚持......
朱令，你不仅仅代表着一个冤屈的个体，而是代表着我们对很多东西的追求和向往
龙应台：“孩子，你是否想过，你今天有自由和幸福，是因为在你之前，有人抗议过、
奋斗过、争... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 24 ☆─────────────────────────────────────☆
bonney (noodle) 于 (Tue Apr 30 23:28:17 2013, 美东) 提到:
我是2005年才知道朱令案的，刚开始我是相信孙维是凶手的， 大家都这么相信的呀，
肯定有原因有道理。 但是最近看了读了了解了很多当时的情形之后， 我却越来越觉得
孙维不是凶手了。
首先是因为2005年底她的声明， 还有就是她的同寝室乃至同班的几个同学都出来支持
她， 在从很多方面看， 孙维不是那种极端忧郁容易钻牛角尖的人， 而是那种活泼，
爱说爱笑， 心眼直， 和同学朋友关系不错的人。 五年的大学生活， 她基本上就是生
活在同学的眼皮子低下的。 她的同学能义无反顾地跳出来支持她， 足以说明她的为人
值得他们相信。
好吧， 现在很多人把支持她的人都说成是她的同伙共谋甚至帮凶凶手， 以解释为什么
他们要支持孙维。 但是我不相信这么多人都是凶手帮凶， 因为能二次投毒杀人还能瞒
这么久， 那得要多极端多可怕多不可思议的人才能下得了手， 而且下两次手， 还能
跳出来振振有词的辩驳， 有这么一个人是可能的... 阅读全帖 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 25 用desalting column试试呢？
或者你把已经有沉淀的样品离心一下，取上清再加点SDS再跑胶。如果你之前加的
loading buffer里的SDS已经把K离子都沉淀下来了的话，应该后来加的SDS就不会沉淀了吧。
不过我不知道你的蛋白是不是也跟SDS一起沉淀了，还是先除盐比较保险。 |
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s*****i
发帖数: 140 | 26 谢谢。
标记完的细胞在加SDS buffer煮样后load SDS-PAGE时还会有挥发性吗？pulse chase我
打算都在hood里做，但是之后的操作(SDS-PAGE，autoradiography等等)在hood里做很
麻烦啊。还有SDS-PAGE的fix solution里面有acetic acid，以及enhance solution貌
似挥发性都很强啊，会有同位素带出来吗？ |
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b******r
发帖数: 111 | 27 Note: NHEs is membrane proteins that transmembrane 12 times. NHE5 is
localized to the plasma membrane;NHE6-9 reside on organellar membranes(
endosome,Golgi);
1. pcDNA transfects NHE5-9 through Fugene 6(ratio is 3 uL of Fugene/2 ug of
DNA) in 293 cells. After three days,collect cells.
2. Cold PBS washes cells. Add 150 uL of lysis buffer(final concentration:
50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% triton, 0.1% sds, cocktail inhibitor)
into each well of 6-well plate. Scrape cells.
3. The lysate gets st... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 28 1) I have no comments, but Dr. Chou has mentioned he was able to reproduce
it.
2) DNA band and migration are easily alternated by sample ionic strength and
buffer. The reason lies in the mechanism of DNA molecule electrophoresis is
so different from SDS-PAGE. DNA band shift is not a unusual result if DNA
sample denature or conformation is not consistent because DNA molecules
migrates on a electrical filed by the negative charge of its own phosphate
groups of which the charge is easily altered by... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 29 一九六八｜六十年代的迟到者：黑人运动，美国的出走与带回
2018-06-23 12:20
1968年，卫星通讯技术的普及让全世界得以同时观看在越南发生的一切。美军的炸
弹在热带爆炸后的琥珀色烟雾、越南村民流下的鲜红血液，让战争第一次具体而又可感
地展示在发达国家市民客厅中的彩色电视机上。触目惊心的电视画面成为了重要的导火
索，促使世界各地几十万人走上了街头。从美国的民权运动，到法国、德国、意大利的
学生／工人运动，再到日本的学生和市民运动，尽管派系林立，反抗对象各有不同——
资本主义、种族主义、官僚主义，“反战”和反美国的帝国主义行径，却成为其中一个
重要的连结。
在1968年，全球对切·格瓦拉的狂热崇拜达到了顶峰——他在1967年10月于玻利维亚被
杀，古巴四处可见切的余韵：“直到胜利，永远”。1968年，越南战争和激进化的黑人
解放运动惊醒了美国曾经封闭而自洽的自我认同，人们开始意识到，国内外的痛苦、灾
难，在帝国框架里是同构的。1968年，阿拉伯世界刚刚经历了上一年“六日战争”的惨
败，数十万巴勒斯坦人在以色列的进攻下流离失所。战败后，阿拉伯左翼以马克思主义
武装了其反殖民运动，... 阅读全帖 |
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o****c
发帖数: 511 | 30 我看了这个漆的SDS，公布的原料都是固体。其他原料都是不需要公布的（无毒害，或
者含量不到reportable level）。 所以你是看不到用了何种solvent或者biocide的。
只有厂家自己知道配方。
latex polymer一般是比较安全的，助剂往往毒性大些，但是助剂用量又很小（0.1-1%
），所以达不到report的量，这也是为什么SDS中看不到。
所以根据公布的信息，不会对胎儿有影响。如果你问我建议，那最好还是加强通风，味
道低些再入住。 或者在家的时候空调开低些，放些活性炭。 99.9%没事，但是谁也不
愿意是那个0.1%
吧。
题外话：你要是看过SDS，保证不敢用这个漆，含有1A类致癌物的，吓人吧。其实不用
担心，是由于结晶石英砂粉末引起的，长期暴露会导致肺癌。但是这些东西都混在水里
了，实际使用反而是很安全的。倒是没公布的助剂成分更让人担心些。肯定含有有助剂
的，而且往往有多种，只是含量低不需要公布而已。 |
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发帖数: 1 | 31 你既然有了 impact driver， 那自然用 impact的好。 我用过 impact driver 随手配
个普通的 drive bit， 也没觉着有问题。
Impact的会在包装上标明的。
bits是不是各家通用? 应该说同一个接口标准的，各家通用。 平时买到那些圆杆钻头
都是通用的。
但钻头还有很多不同接口种类， spline, SDS， SDS plus， SDS Max，还有方形的，
用来钻水泥，砖头, 石头。 同一个接口标准的，各家通用。 |
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b***y
发帖数: 374 | 32 http://etfdailynews.com/blog/2010/06/08/do-you-trade-like-mr-x-with-
triple-x-etfs-fas-sds-tza/
Need read above:
Do You Trade Like ‘Mr. X’ With ‘Triple X ETFs’? (FAS, SDS, TZA)
quote: “This is the wrong way to approach the leveraged ETF industry — or
any type of investing, for that matter. Leveraged ETFs, like Direxion’s
Daily Financial Bull 3X (NYSE:FAS), or the ProShares UltraShort S&P 500
ETF (NYSE:SDS) are designed for sophisticated investors making short-term
trades. In some portfolio strat |
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p*********r
发帖数: 7944 | 33 周末盘货
401K account
$13500大盘基金 （high tech $2000）
$26000 Bonds基金
$10000 tips基金
IRA account
CAF 100股
RSX 100股
LQD 35股 （撤退之后）
ABX 100股
MOS 100股
AMGN 10股
ISR 100股
NFLX 5股
SDS 100股
SDS 0404 put -2合同
CHTP 200股
SDS 200股（加0404，28.5 cc）
TSLA 15股
taxable account
空仓 |
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C*****5
发帖数: 8812 | 34 3/1卖掉了一半SDS
3/8号加CHAU，换成一半SDS+一半CHAU
SDS+CHAU这个组合基本上没怎么动。今天是负的。看A股今天这个走势明天应该能正了。
A股账号全仓沪深300ETF收益不错。
有需要我可以贴交易记录。动车我从来讲究的是一身正气。实事求是。 |
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d*****1
发帖数: 8618 | 35 今年第二次进场 今天17.3重新买入了1/3仓位sds 胆子小 只敢玩sh/sds
如果大盘到2200再加仓1/3 sds 否则就一直hold不动
目标出货区间 2070-2050 |
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t******n
发帖数: 2939 | 36 ☆─────────────────────────────────────☆
Psalmist (I'LL BE BACK!) 于 (Mon Apr 29 01:20:38 2013, 美东) 提到:
这人究竟是想搞易方达，还是想搞潘峰？他卖私货的迹象很重。
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BabiRabbit (Hello) 于 (Mon Apr 29 01:38:40 2013, 美东) 提到:
whatever,
ding
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Sophiaa (索菲呀) 于 (Mon Apr 29 01:48:13 2013, 美东) 提到:
这人无理取闹了。搞孙唯可以，骂铊党也应该。但是因为易方达没有满足自己的要求就
号令网民们倾家荡产的去做空易方达，有病吧，易方达跟朱令的案子都没什么直接关系
。公安局还没满足他的要求呢怎么不去公安那儿闹呢？还见证历史呢。根本不是想解决
问题的人，完全是在制造混乱。
☆───────────────────... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 37 ☆─────────────────────────────────────☆
zhau (Zhau) 于 (Mon Apr 29 22:36:33 2013, 美东) 提到:
当年，为了确定朱令体内的铊来自清华李隆弟和童爱军的实验室，警方费了多大的力气
啊。他们走遍了北京所有使用铊的单位，最后又转战外地，最终在石家庄找到了清华购
买铊的证据。最后，又根据化验结果，证明了朱令所中的毒就来自那批铊，就来自那个
实验室。所以，确定一个犯罪嫌疑人，不是那么容易的事。需要大量的实物证据和科学
数据，否则，警方无法向检察院提交证据，无法要求对某人采取强制措施的。
(^.^)。。......
清华开始不承认自己学校有坨的，后来警方拿出来那个清华买坨的发票，清华才承
认自己学校买过坨！！！清华 ，你够清澈吗！！！！！
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icefish (哆拉A梦) 于 (Mon Apr 29 22:37:52 2013, 美东) 提到:
原来还有这种事，清华的形象跌至谷底
☆──────────────────────... 阅读全帖 |
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c***t
发帖数: 383 | 38 ☆─────────────────────────────────────☆
fwde (猫爱音乐) 于 (Fri May 3 09:58:18 2013, 美东) 提到:
根据相关法律法规和政策，“朱令”搜索结果未予显示。
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CleverBeaver (Clever Beaver) 于 (Fri May 3 10:00:09 2013, 美东) 提到:
记得有个叫aaron 啥的少年黑客枉死，因为mit曾经involve 于他的案件，被一些人认
为间接导致了他的死，于是乎mit 的网站和某政府网站一起down 了一会儿。mit 因为
终究是mit, 网站并没有被黑客完全攻陷，只是部分瘫痪，但是这件事引起很多人的关
注，有相关人员引咎辞职。
有些时候一些不完全正面的手段的运用可以带来好处多过于坏处，是可以容忍的。
如果谁能黑掉白宫或者new york times，bbc，哪怕是哈佛 的网站，把朱令的故事哪怕
贴上半天，都
够引起足够关注了。
☆────────────────────... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 39 ☆─────────────────────────────────────☆
CDN (mimi) 于 (Wed May 1 09:52:18 2013, 美东) 提到:
如果你是孙维，即便你是清白的，建议你也不要去要求什么案件重启。
看到那几个为你在网上辩护的同学们的遭遇么？
如果案件重启，将没有人敢于为你出庭作证，没有人敢于做你的辩护律师
即便他们相信你的清白，但谁愿意被暴民骚扰，没有安宁的生活，孩子没有安全，甚至
正常工作都丢掉。对不起，人都是要先顾自己的。
当局？当局恨不得找一个替罪羊，转移民众对体制的不满，把这个案件中警方的疏忽，
清华的掩盖和推卸责任，协和的愚蠢都掩盖掉； 当局? 他们巴不得让民众把这些年对
司法系统不公的不满，对权势阶层的愤恨统统发泄到你的身上。
所以案件重启，极有可能办成冤案，千万不要天真地去促成什么案件重启，如果你的家
族还有什么影响力的话，一定要千方百计地阻止案件重启。
所以你就自认倒霉吧，没有任何人可能还你清白，当年的警察们不能，现在的重审也不
能，
谁让你和朱令住一个宿舍，谁让你早早地参与课题呢？怪就怪你生在这个时代，一个民
众对司... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 40 ☆─────────────────────────────────────☆
ympc (bear) 于 (Wed May 1 13:25:20 2013, 美东) 提到:
都一个德行？
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sequel (暴力云) 于 (Wed May 1 13:25:52 2013, 美东) 提到:
被骚扰总比坐牢强吧？
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ympc (bear) 于 (Wed May 1 13:29:16 2013, 美东) 提到:
就没一点点底气面对公众？
我一个都不认识，我要是认识其中一个就问问。
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CDN (mimi) 于 (Wed May 1 13:37:38 2013, 美东) 提到:
他们就是因为面对公众才被骚扰的
更多地面对公众，会更多地被骚扰
除非他们改变立场，按照暴民们的要求指孙维为凶手
☆─────────────... 阅读全帖 |
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b***a
发帖数: 11 | 41 hehe, never boil that yellow sample, or you risk degrading your sample.
the yellow color comes from bromophenol blue which turn yellow under acidic pH
and protein will be degraded under acidic condition.
Put extra tris base in your SDS-PAGE buffer to neutralize residual acid. Don't
worry about the undissolved pellet. TCA-precipitated protein should be easily
dissolved by boiling in SDS buffer. Undissolved stuff is likely to be other
stuff.
washed it with ice-cold acetone. I put SDS-PAGE buffer |
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r****n
发帖数: 4 | 42 Good point!
I am sure that the precipition was caused by potassium ions which complex with
SDS and become insoluble. You should remove potassium ions from your SDS
extraction solution by using sodium salt.
I do think your protein concentration is too high because I even used much
higher protein concentration for my protein 2d electrophoresis. But for
SDS-PAGE, you can not load too much protein even with a concentrated sample.
You still have to dilute your sample. I usually load 20-30 ug for my |
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C******n
发帖数: 941 | 43
interfere
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ this is not harsh to
disolve
all proteins, like some membrane proteins, they are really hard to disolve.
High concentration of TritonX-100 will affect SDS-PAGE, you can try 8M urea,
or you can even add 8M urea when casting the SDS-Gel, search methods with key
words like" disolve membrane proteins", "membrane protein SDS-PAGE", you'll
get more informative stuff.
Good luck
can
buffer |
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b********i
发帖数: 73 | 44 Not sure why you have to use SDS-free lysis buffer. I assume that someone
told you, maybe your PI, right?
1% SDS lysis buffer is quite standard. If you do not have specific reason
to avoid it, such as studying
chromatin binding complex, 1% SDS is fine for most of transfection factor
binding studies.
deoxycholate |
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m***o
发帖数: 272 | 45 谢谢楼上两位。但是我们实验室以前的一个postdoc确实是用SDS free的裂解液做出的
很多结果。刚开始也是用1%SDS，结果总是不好才改的。不过既然大家认为1%SDS is
stardard,I think I will try this. Thank you all! |
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v*********i
发帖数: 40 | 46 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
的。
我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
所以想发上来让大家评评理。
我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
可是老板说做蛋白都得加蛋白酶抑制剂，你不是说自己以前做过很多蛋白质实验吗，你
要是没做过就说没做过，我可以让其他人教你，你要是不知道怎么做，要主动问别人，
看看人家怎么做的，等等。
还说，你怎么不测蛋白浓度；我就解释说我觉得不需要测蛋白浓度，以前我都不测，因
为转染的时候起始细胞数量是一样的，蛋白量应该差不多，加actin内参看一看就应该
知道平不平了；另外加了SD |
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C******r
发帖数: 790 | 47 我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 48 从current protocol上改的：
1. check OD600；
2. harvest X ul induced or uninduced culture;
3. add Y ul 1x SDS-PAGE loading buffer (Y=OD600*X/10);
4. Vortex for 30s;
5. 100C for 5 min;
6. 15,000x g for 5 min;
7. Load 5-20 ul supernatant to SDS-PAGE gel.
你也可以向楼上所说，把soluble和insoluble的fractions分离后再SDS-PAGE. |
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j*****a
发帖数: 658 | 49 I am not sure if I understand you well...I thought the difference of non-
ionic (NP40, Triton X100) and ionic (SDS, sodium deoxycholate) is non-ionic
lysis buffer doesn't denature protein. Some of the antibody that recognizes
only non-denature antigen (original state, you might want to say) so that
you can't get good results if you use denature lysis buffer (SDS) with these
antibodies. In anothe word, non-denature lysis buffer is more safe. Am I
wrong?
So I am confused with what you said about "... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 50 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。
蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关，和蛋白本身的构型也有一定关系。
经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的，这个对于大部分
蛋白是对的，但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。 |
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