s****z
发帖数: 50 | 1 有一个gene，如果把它knock down后细胞就会死掉
如果用shRNA做knock down实验，如何验证knock down efficiency呢？
谢谢！ |
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s****z
发帖数: 50 | 2 用的virus infection.
empty vector and control shRNA 对细胞没有影响 |
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j********r
发帖数: 156 | 3 Is there any disadvantage of using siRNA transfection for some functional
assay, such as cell viability or cell death? Can anyone recommend a vendor
for
synthesize dsRNA (if the target sequence is already known for efficient
knockdown, based on the use of shRNA)? Many thanks,
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w****u
发帖数: 1078 | 4 I tried retrovirus for OVER expression on murine primary T cells, there are
>60% infection. So, if lentiviral shRNA are not good for infection. Is that
better to clone this into retrovirus vector? thanks |
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p********i
发帖数: 116 | 5 请问 现在在线的shRNA都用哪个设计，给推荐一个吧。找了个ambion在线的，弄了6个
一个都没效。谢谢！ |
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s*********y
发帖数: 387 | 6 使用shRNA的全基因组库，做细胞功能的丧失方面的筛选，使用flow做为assay readout.
目前在看MISSION® LentiPlex™ Pooled Libraries，有时用过的朋友给些
建议吧，谢谢！
当然，如果有其他牌子的Pooled libraries的经验或者建议，也非常的欢迎！
谢谢 |
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b**********8
发帖数: 349 | 7 如题，Clontech公司的，自己买回来构建某基因的shRNA质粒，在一种肿瘤细胞株里加
Dox诱导后work perfectly，但是在同一肿瘤系的其它细胞株里就不work，或者不是那
么efficiently，有什么原因可以解释？欢迎讨论和建议。 |
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j**W
发帖数: 89 | 8 这个addgene的lentiviral tet-on/off可以同时放shRNA和cDNA?有link吗?attL同时要
放在两个地方，怎么弄呢？ |
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a****k
发帖数: 1130 | 9 transfection of shRNA will induce interferon response |
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p********i
发帖数: 116 | 10 shRNA直接转到细胞里也会被转录有？应需要promoter吧。 |
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m******m
发帖数: 535 | 11 谢谢了！
不过为什么不能直接合成shRNA然后转染呢？ |
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m******m
发帖数: 535 | 12 谢谢！
不过如果文献上已经查到了好用的shRNA序列，为什么不能直接合成然后转染呢？siRNA
买个pool要好多美刀呢，可是缺很难查到有报道的好用的siRNA序列去合成转染。 |
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m****m
发帖数: 4741 | 13 the off-target effect of shRNA might be a big concern |
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C*****h
发帖数: 926 | 14 No, using virus to deliver shRNAs to T cells is not a viable option.
You can never have enough viruses to infect human cells.
function |
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b**********8
发帖数: 349 | 15 我觉得是可行的，screening的时候最好把这个基因的shRNA plasmid和带flag标签的该
基因的表达质粒共转，3,4天后收蛋白做WB，用anti flag的抗体去检测，效果更明显。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 16 我觉得是可行的，screening的时候最好把这个基因的shRNA plasmid和带flag标签的该
基因的表达质粒共转，3,4天后收蛋白做WB，用anti flag的抗体去检测，效果更明显。 |
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z*y
发帖数: 84 | 17 Could you please explain the principle? Why is luciferase affected by
unrelated shRNA?
Thanks.
）， |
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h******y
发帖数: 55 | 18 用sicheck2 plasmid来筛shRNA。
包子 |
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b**********8
发帖数: 349 | 19 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 21
是一样的，我们一直使用的sigma 的 PLKO.1-puro-shRNA 质粒，我现在每次都是从师
姐留给我的那管质粒中取一点出来做转化然后midiprep。 |
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f****6
发帖数: 1 | 22 本人发现target sequence 19nt--21nt的shRNA 的效果不好。 |
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t****g
发帖数: 120 | 24 我最近一直在做一个gene的knockdown cell line。 用的是open biosystems的pLKO.1
system。 try了三个不同的cell lines，发现一个普遍问题： 细胞养了一个月之后我
就不同程度地丢失了最开始的knockdown. 我会详细解释一下我的做法，请大家帮我看
看问题到底在哪儿：
day 1: plate cancer cells for transduction
day 2: add virus/polybrene to cells (half volume of media) in the morning;
6hr later, add the other half volume of media to dilute polybrene
day 4: change to selection medium
day 5: in my case, usually the cells have become confluent before the effect
of antibiotics became obvious. I had t... 阅读全帖 |
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C***Y
发帖数: 61 | 25
1
effect
the
It is common issue with shRNA knockdown, so do not get frustrated. If you
can get enough cells for downstream experiments at day 5 or 6, just harvest
cells at that time point, otherwise, I suggest you use inducible knockdown. |
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q******g
发帖数: 3858 | 26 我们用pLKO.1也有同样的问题。一般都是在split cell后一天，才加入puromycin. 一
般经过3-4天，没有感染的细胞（negative control）会全部死去。这个时候，你可以
冷冻一些细胞，用于以后的实验。而经过删选的细胞用过2-3周，就不用了。使用冷冻
的。
knockdown efficiency我的基因也只有60%左右。我觉得这个和shRNA的设计有关。当然
，很多公司会重新给你设计或者退款，如果达不到80%。 |
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X******n
发帖数: 914 | 27 有那个公司可以做genome-wide shRNA screen嘛？ |
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k****n
发帖数: 42 | 28 刚从虫子转到哺乳系统， 大家一般都是从哪个网站去找一个基因的promoter的？
然后有没有一些网站会帮你设计shRNA hairpins 序列的？ 谢谢了 |
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h********n
发帖数: 4079 | 29 高人们能不能推荐一个lentiviral vector, 可以表达两个外来的gene, 比如
luciferase 和 Cre, 同时还能表达一个shRNA?
tyler jacks的那个 UbC.Luciferase.PGK.Cre 好用吗?
谢谢谢谢. |
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f******g
发帖数: 1003 | 31 和载体也有关系把，最好买现成的，shRNA克隆也挺费劲的，测序
Open Biosystem |
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S*********s
发帖数: 304 | 32 不是必须的。
目前我用过的pSuper, pSuperior, pLKO,pSingle系列的都没有这个要求
最有可能的是原作者多加了
但我觉得根据shRNA的原理多了这个C对原作者的基因应该也work. |
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b**********8
发帖数: 349 | 33 谢谢楼上各位的关注，再贴一个Plenti lox3.7这个vector自己的mannual，里面也建议
在poly T之前要加一个互补的C的。看来不同的vector要求不同，我已经把oligo发出去
了，一下子设计了5对shRNA，希望回来都能work，否则老板的脸又要黑了。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 34 能包装慢病毒的，knockdown效率高的，能否给个sequence和vector的信息？最近整这
个，用的plenti lox3.7，在sigma的网站上抄了4条shRNA,买回来自己退火连接做克隆
，转到293T里面，western blot发现都没效果，郁闷死了。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 35 为啥不直接买Open Biosystems的lenti shRNA |
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b**********8
发帖数: 349 | 36 嗯，昨天跟boss讨论了下，认为这个钱还是要花的，准备买他家的那个shRNA set，用
的PLKO.1 vector，一个set里面5个克隆，就是想问问有谁用过这个吗？5个里面有几个
OK
？万一买回来都不行，退货倒是小事，关键是时间赔不起。【 在 hellowhy (夹死do
it) 的大作中提到: 】 |
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D******9
发帖数: 2665 | 37 有没有人比较过同样的working SEQUENCE， siRNA还是shRNA的KD效率高？不塞选
stable cells. 转染siRNA或转导Lentivirus后2-3天比较。 |
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X******n
发帖数: 914 | 39 有没有大牛用THP-1 细胞做shRNA knockdown啊？能不能分享一下经验？我试了很久，
都不work啊。病毒转染效率太低了。急死人了。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 40 主要是蛋白半衰期太长（PCR有效，WB不行），
另外可能蛋白抑制后，生长劣势（PCR， WB都不行），或者shRNA序列不行。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 41 shrna效率太低，换一个试试。另外蛋白太稳定，你用的transient还是lentivirus？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 42 也可以考虑换一个抗体试试。
我就在自己的project中发现，转导lentivirus shRNA后，qRT-PCR能看到70%以上的
knockdown，但是western没差。后来买了个识别C-terminus的抗体就能看到很明显的差
异（之前用的是识别N-terminus的抗体）。至今仍不解这是为什么，有大侠解释下么？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 43 LZ pls try long hairpin RNA (lhRNA)
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
its pp130 left column
Functional screening using lhRNA expression libraries also appears to
be more efficient than using shRNA expression libraries for these
organisms.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114 |
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j***x
发帖数: 1469 | 44 我想跟踪这篇文章，因为覆盖了我们的领域，其中的RNA-seq， ChIP-seq 对我们的领
域有不小的帮助。 我想自己合成shRNA， 一blast发现， 质粒是错的，两个基因缩写
一样！！！
这种情况怎么处理？
给Nature写信， 肯定撤稿吧？ 因为质粒是错的，敲的是别的东西， 缩写是一样的。 |
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l****b
发帖数: 400 | 45 是不是retract得看看这个东西是不是占文章的主要部分了。
还有一个问题，那就是用这个错的shRNA居然target gene 的蛋白以及功能都会做出来
被下调了(我suppose他们应该会show这些结果吧）？呵呵。天下文章就是一大忽悠啊。
我还曾经听说有人只给了buffer骗人家说
是抗体，结果几天后漂亮的western blot终究还是做出来的笑话。嘿嘿，我小人之心了
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j***x
发帖数: 1469 | 46 这是个control shRNA质粒，所有的升高，降低都是以这个质粒为基准。 |
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h*****9
发帖数: 4028 | 47 shRNA或者miRNA的文章很多都是胡扯淡的。没有KO支持，我一般不太相信其结果。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 48 这个control shRNA是target什么protein的？
如果是target GFP或者LacZ之类的东西，对结论也没啥影响吧。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 49 这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
要解决只能挑克隆了。 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 50 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧 |
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